尼达尼布(nintedanib)的体外抗新血管生成作用

　　特发性肺纤维化的特征是外周肺组织逐渐形成疤痕和变硬，从而降低肺功能。在疾病的过程中，肺微血管系统经历了广泛的重塑。纤维化病灶周围的血管生成增加，病灶内没有微血管。为了阐明抗纤维化药物尼达尼布（nintedanib）如何作用于血管重塑，我们在微流控芯片中使用了由原代内皮细胞和原代肺成纤维细胞制成的可灌注微血管的体外模型。微血管模型使我们能够研究尼达尼布对渗透性、血管化面积和细胞间相互作用的影响。nintedanib的抗血管生成作用在 10 nM 的最低浓度下可见，显示血管通透性显着增加。此外，尼达尼布降低微血管密度、直径，并影响内皮微血管周围的成纤维细胞组织。这些结果表明尼达尼布作用于内皮网络形成和内皮-血管周围相互作用。因此，先进的体外微血管系统模型可能有助于确定抗纤维化药物对 3D 微血管重塑的机械作用，并完善动物研究的结果。

　　特发性肺纤维化 (IPF) 是一种慢性进行性肺部疾病，其中外周肺的进行性瘢痕形成最终导致肺功能丧失。IPF 的生存预后较差，诊断后的中位生存期为 2-3 年 。一些患者进展缓慢，而另一些患者会出现急性加重，导致肺功能迅速下降 [2]。IPF 的根本原因仍然未知，但已经确定了几个风险因素。吸烟、接触污染物、遗传易感性、病毒感染、胃食管反流和衰老都会增加患 IPF 的风险。

　　本研究的目的是研究抗纤维化药物尼达尼布如何作用于孤立的 3D 微血管网络上的血管重塑。首先，我们通过在 3D 纤维蛋白凝胶网络内共培养原代人肺成纤维细胞和原代人脐血管内皮细胞 (HUVEC)，建立了一个 3D、稳定且可灌注的微血管网络。其次，我们通过研究血管通透性、血管密度、成纤维细胞侵袭和内皮-成纤维细胞相互作用的变化，探讨了尼达尼布在这种微血管结构体外模型中的影响。

　　尼达尼布对细胞增殖和活力的影响

　　我们在用尼达尼布治疗 4 天和 7 天后对细胞进行了活/死染色。尼达尼布在浓度高达 100 nM 时对 HUVEC、NL-FB 或它们的共培养物没有抗增殖作用。为了评估尼达尼布的细胞毒性，我们使用了 alamarBlue，这是一种比色测定法，其中吸光度与活细胞的数量有关，并取决于代谢活性。尼达尼布没有表现出细胞毒性作用，并且在用浓度高达 100 nM 的尼达尼布处理 7 天后，细胞仍保持活力。单一培养和共培养的增殖和活力表明，在这种情况下，100 nM nintedanib 没有细胞毒性。

　　尼达尼布增加微血管通透性

　　我们微流控芯片的特殊设计能够在中央腔室中自组装一个可灌注的微血管网络，使我们能够研究尼达尼布对微血管屏障完整性和渗透性的作用。未经处理的芯片和用 10 nM 尼达尼布处理的芯片用 70 kDa RITC-葡聚糖灌注，荧光染料填充中央室的微血管结构。在 10 nM nintedanib 存在的情况下，染料渗漏到间隙空间中，而在未处理的网络中未观察到微血管壁渗漏。对于未处理的芯片，计算出的渗透系数为 (1.5 ± 0.32) × 10-6cm/s，对于用 10 nM nintedanib处理的芯片，计算的渗透系数为 (1.04 ± 0.36) × 10-3cm/s。因此，尼达尼布治疗显着（p < 0.0056）增加了微血管通透性。计算未处理和 10 nM 尼达尼布处理芯片的渗透系数，因为在较高浓度的尼达尼布下，可灌注微血管结构的形成受到抑制。在未处理和 10 nM nintedanib 设置中，微脉管系统更加流线型，并通过调整后的梯形开口向侧微通道开放，而用 30 和 100 nM nintedanib 处理的网络具有更多曲折的微血管，这些微血管在很大程度上靠近通路柱（补充材料图 2）。 S1)。

　　在我们的模型中测试尼达尼布之前，我们评估了其对浓度高达 100 nM 的 HUVEC 和 NL-FB 的单培养和共培养的细胞毒性。Alamar blue 和活死细胞染色分析表明，所有细胞培养物在暴露于高达 100 nM 的 nintedanib 处理时都保持其活力和增殖。这一结果与之前的报告形成对比，在之前的报告中，用尼达尼布处理 VEGF 或 bFGF 刺激的 HUVEC 导致细胞增殖和凋亡的抑制，EC50值分别小于 10 和 290 nM。然而，在本研究中，HUVEC 被 VEGF 和 FGF（存在于完全补充的 EGM-2 培养基中）刺激，因此预计它们对尼达尼布的毒性作用更持久。先前的研究表明，尼达尼布浓度高达 1 μM 时，没有证据表明对人肺成纤维细胞有急性毒性 。还表明，尼达尼布仅在高于 500 nM 的浓度下才能显着抑制肺成纤维细胞的增殖。

　　有趣的是，尽管尼达尼布对细胞活力和增殖没有不利影响，但在微血管形成过程中在芯片上给药时，它会在低至 10 nM 的浓度下影响体外微血管系统。为了直接比较，我们选择的尼达尼布片上给药浓度约为人血浆中浓度的 0.7 至 1.4 倍。

　　我们试图探索尼达尼布的抗血管生成和抗血管生成作用，目的是评估其在 IPF 治疗中的应用，但我们的方法有两个注意事项。我们在体外微血管系统模型中使用了 HUVEC，但 HUVEC 在基因表达和形态方面与肺血管内皮细胞不同。我们还使用了正常肺成纤维细胞，它们的 PDGFR 和 FGFR 表达水平与 IPF 成纤维细胞不同。理想情况下，体外模型中的微血管结构将模拟 IPF 病理学，如果来自 IPF 患者的成纤维细胞与内皮细胞一起接种到芯片中，这可能是可能的。这种体外患病微血管模型对于药物发现和测试非常有用。

　　先进的体外微血管模型为研究尼达尼布（nintedanib）等治疗药物的作用模式开辟了新的前景。这些实验平台可以解决药物对血管生成和血管生成的影响的基本问题，未来可用于开发和优化个性化血管系统模型中的药物治疗。总之，我们的工作表明，临床相关浓度的尼达尼布治疗不会影响细胞活力，但确实通过放松血管屏障完整性、增加通透性、缩小微血管、降低血管密度和防止内皮脉管系统周围的成纤维细胞组织而显着影响新血管生成。之前已经在体内研究了尼达尼布对微血管结构的影响，我们的人体微血管体外 3D 模型代表了一种令人兴奋的方法，因为它允许研究尼达尼布对分离的人体微血管的影响，并比体内研究更详细地解析细胞间相互作用。微信扫描下方二维码了解更多：