卡博替尼Cabozantinib以p53无关的方式诱导CRC中的PUMA表达

　　为了研究卡博替尼（Cabozantinib）对CRC的作用，我们用卡博替尼处理了CRC细胞。用5μmol/ L卡波替尼处理后，HCT116细胞在蛋白质和mRNA水平上均呈时间依赖性地显着上调了PUMA的上调。抑制HCT116细胞中的p53（p53-KD）不会对卡博替尼产生反应而对PUMA诱导产生不利影响，并在其他经过测试的结肠癌细胞系中发生，例如p53-WT Lim2405和LoVo细胞系以及p53突变的DLD1和HT29细胞系。此外，卡波替尼治疗并未导致凋亡前Bcl-2家族蛋白Bim和Bid的上调。然而，卡博替治疗抗凋亡蛋白Mcl-1的和Bcl-X的水平降低大号。这些发现表明，卡波替尼不考虑p53的状态而诱导PUMA，可能介导其他抗癌作用。

　　卡博替尼在CRC中诱导p53依赖性PUMA诱导。一个父母和稳定的p53-Knockdown（P53-KD）HCT116细胞在指定的时间点用卡博替处理。通过实时逆转录酶（RT）PCR分析卡波替尼对PUMAmRNA的诱导作用，以β-肌动蛋白为对照。在指定的时间点用5μmol/ L卡波替尼处理HCT116细胞。提取总RNA，并通过半定量逆转录PCR（RT-PCR）分析PUMAmRNA的表达。β-肌动蛋白用作对照。

　　在指定的时间点，用卡博替尼处理的HCT116细胞通过蛋白质印迹分析PUMA蛋白水平。亲本和稳定的p53-敲低（p53-KD）HCT116细胞用5μmol/ L Cabozantinib处理24小时。通过蛋白质印迹分析PUMA表达。用5μmol/ L 卡博替尼处理不同p53状态的CRC细胞系24小时。通过蛋白质印迹分析PUMA表达。在指定的时间点，用5μmol/ L卡波替尼处理的HCT116细胞中的Bcl-2家族成员表达的蛋白质印迹。的结果表示为三个独立实验的平均值±SD。

　　为了研究PUMA在卡博替尼诱导的细胞凋亡中的作用，我们生成了其中的PUMA被稳定敲低的HCT116细胞（PUMA-KD）。响应PUMA的抑制作用，卡波扎尼替勃依赖性细胞凋亡显着减少，通过Annexin V / PI染色证实了这一点。同样，卡波替尼诱导的caspase 3和9激活。以及细胞色素C的释放，与线粒体凋亡过程一致的事件在PUMA-KD HCT116细胞中减少了。长期菌落形成试验证实了卡博替尼治疗后这些PUMA-KD细胞的存活率提高了。因此，PUMA表达对于卡波替尼介导的CRC细胞凋亡至关重要。