EBC-1细胞系，是具有MET的NSCLC细胞系扩增产物购自JCRB细胞库。通过逐步暴露于终浓度分别为1.5、2.2和2.4μmol/ L的卡马替尼（INC280）来建立耐卡马替尼的EBC-1细胞系（EBC-CR1，-CR2和-CR3），并且从没有这种细胞的情况下不从其中选择一个克隆。将EBC-CR1，-CR2和-CR3细胞维持在1μmol/ L卡马替尼中2个月以上，并通过多种耐药机制进行选择；这些被称为卡马替尼耐药细胞系。将所有细胞系在37°C培养箱中，在含10％FBS，2 mmol / L L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中孵育。卡马替尼（MET抑制剂），克唑替尼，阿法替尼，BYL719，PD1730-74和BGJ398（FGFR抑制剂）购自Selleck Chemicals。卡马替尼的制备浓度为5 mmol / L，其他药物制备为10 mmol / L的100％二甲基亚砜储备溶液。重组肝素结合型EGF样生长因子（HBEGF）购自Prospec。
为了确定细胞系在体外对这些抑制剂的敏感性，将细胞以5,000个细胞/孔的密度接种到96孔微孔板中，并在暴露于药物之前在培养基中孵育24小时。将细胞与抑制剂的连续稀释液以200μL/孔的终体积孵育72小时。温育72小时后，将Ez-cytox添加到每个孔中，并将板在37℃温育器中温育3小时。使用Eon Microplate分光光度计在450nm的测试波长下测量光密度。IC50值是通过Sigma Plot 12计算的。将细胞以5×105的密度接种到6孔板中每孔进行细胞周期和凋亡分析。24小时后，将细胞用抑制剂处理72小时。收集贴壁细胞和浮细胞，并用碘化丙锭（1.0 mg / mL）和RNase A染色。
在6孔板中生长至足够密度的EBC-1亲本细胞和EBC-CR1，-CR2和-CR3细胞系，单独用卡马替尼治疗2小时，用卡马替尼和阿法替尼联合治疗24小时，或24小时与BYL719。兔单克隆抗体，用于检测磷酸-MET（Tyr-1234 / 1235），磷酸-EGFR（Tyr1068），磷酸-STAT3（Tyr705），磷酸-AKT（Ser473），总MET，总EGFR，总AKT，总p44 / 42 MAPK，3-磷酸甘油醛脱氢酶和用于检测总STAT3的小鼠单克隆抗体购自Cell Signaling Technology。小鼠抗磷酸化p44 / 42 MAPK（Thr-202 / Tyr204）购自Santa Cruz Biotechnology。
细胞用改良的Dulbecco磷酸盐缓冲液洗涤一次，并在含有0.025 M Tris，0.15 M NaCl，0.0001 M EDTA，1％NP-40和5％甘油（pH 7.4）的缓冲液中溶解。将蛋白G / A琼脂糖树脂与兔单克隆抗MET抗体，抗EGFR抗体或兔IgG对照孵育2小时，作为阴性对照，将1 mg蛋白质的细胞裂解液与抗体偶联树脂在4°C混合过夜。使用Pierce Co-IP试剂盒进行共免疫沉淀。洗涤，洗脱并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离免疫沉淀。如上所述进行蛋白质印迹。
使用RNA Mini Kit从EBC-1亲本和耐药细胞系中提取总RNA，并使用Superscript III逆转录酶进行逆转录。使用StepOnePlus实时PCR系统扩增cDNA，并使用SYBR Green PCR Master Mix和特定引物进行定量实时逆转录聚合酶链反应。使用Δ-肌动蛋白作为参考基因，使用ΔΔCt（循环阈值）方法计算相对基因表达。如上所述，从EBC-1和抗性细胞系中提取RNA。归一化的读取计数计算为（log2）> 6，并且调整后的p <0.05的基因被认为显着差异表达。
EBC-1细胞来自具有MET扩增功能且对MET-TKIs具有高度敏感性的NSCLC细胞系。为了探索对MET-TKI耐药的分子机制，我们使用了卡马替尼，一种目前正在临床试验中的MET抑制剂。使用EBC-1细胞系，通过逐步暴露于10nM的卡马替尼至终浓度为1.5、2.2和2.4μmol/ L，我们建立了总共三种对卡马替尼耐药的细胞系（EBC-CR1，-CR2和-CR3） ，分别观察各种耐药机制。EBC-CR3细胞系源自EBC-CR1细胞系，在另外3个月中连续暴露于较高浓度的卡马替尼。首先，我们通过细胞活力分析评估了所有三种耐药细胞系对卡马替尼的敏感性。MET-TKI对耐药细胞系无毒性（IC50，在EBC-CR1-3细胞上> 10μmol/ L，在EBC-1细胞上3.70±0.10 nmol / L；而在G1下，18.15±3.31％ 。接下来，我们通过qPCR证实了耐药细胞系中MET基因拷贝数的减少，同时伴随着MET磷酸化的下调。卡马替尼不仅强烈影响激酶活性，而且还显着影响MET拷贝数，表明其对MET依赖性肿瘤的有效疗效。现在卡马替尼的价格多少？更多详情可咨询下方微信。
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