克唑替尼Crizotinib如何敏化耐埃洛替尼的HCC827GR5细胞系

　　本研究支持厄洛替尼和克唑替尼在NSCLC细胞中的协同相互作用中的遗传特性和溶酶体功能的潜在作用。　　

　　通过评估具有EGFR外显子19缺失的HCC827细胞系和还具有cMET扩增作为对吉非替尼的耐药机制的HCC827GR5细胞，可以得出这一新发现。EGFR-TKI厄洛替尼和cMET-TKIcrizotinib的联合治疗在HCC827GR5细胞中产生了非常强的协同作用。相反，在cMET扩增的EBC-1或EGFR突变的H1975（L858R+T790M）细胞系中未观察到协同作用。　

　　cMET和EGFR的信号传导通路紧密缠绕在一起，这可能导致厄洛替尼和克唑替尼之间产生协同作用。但是，EGFR的野生型EBC-1细胞系具有cMET扩增，仅显示了该组合的加和作用。因此，激活的EGFR突变似乎对协同作用至关重要。总而言之，这些数据促使我们专注于HCC827GR5细胞，并将所有实验与亲本HCC827细胞系进行了比较。　　

　　厄洛替尼和克唑替尼之间的协同作用也反映在伤口愈合试验中，只有这种组合才能抑制HCC827GR5细胞系中的细胞迁移。已证明cMET的激活可刺激细胞迁移，而EGFR也是如此。然而，值得注意的是，具有两个像差的细胞系迁移速度是亲代细胞系的两倍，这反映在对照伤口闭合所需的时间上。　　

　　对sub-G1部分的分析也与在HCC827GR5细胞系中发现的协同作用相一致，而在亲本细胞系中，厄洛替尼的作用比联合作用要强一些。此外，细胞周期分析显示，厄洛替尼后G1停滞和克唑替尼后G2/M停滞，这与文献一致。但是，联合用药后，克唑替尼的疗效显着，但比单药治疗后弱。　　

　　值得注意的是，当比较两种细胞系的3D培养时，这种协同作用得到了进一步体现。通过最近验证的方法，通过对3D生长模式不同的亲本HCC827和HCC827GR品系的细胞聚集进行分析，我们确实发现该组合显着降低了HCC827GR中球状体的细胞聚集，而仅在HCC827细胞中检测到轻微降低。　　

　　为了确定协同作用是否是由于对cMET和EGFR下游信号传导的联合抑制或其他机制是否起重要作用，我们比较了亲本细胞系和HCC827GR5克隆的下游磷酸化。总体而言，两种细胞系对不同处理条件的反应都非常相似，因此无法对HCC827GR5细胞的协同作用做出令人满意的解释。几种酪氨酸受体激酶的基础活性差异最大，约为600％。但是，在HCC827亲本细胞系中，这些激酶的活性低于基线，而在HCC827GR5中，这些激酶的活性仅高于基线。这使得这些值之间的比较非常困难。此外，在HCC827和HCC827GR5单元中，　　

　　接下来，我们关注药物的细胞药代动力学。克唑替尼和吉非替尼都被称为疏水性弱碱化合物。这些弱碱能够自由穿过质膜和细胞内膜。这些化合物也可能在溶酶体中积累，而这种积累是由细胞质和溶酶体之间的pH分配驱动的。溶酶体的低pH值会导致多个弱碱TKI的质子化，从而阻止这些碱的膜交叉并导致溶酶体中的积累。这会导致溶酶体应激，并通过TFEB转录因子激活溶酶体的协调表达和调控（CLEAR途径）。这种积累也可能触发溶酶体胞吐作用的激活，从而使溶酶体在微管上移动，与质膜融合，并将其货物释放到细胞外环境中。另一方面，厄洛替尼与细胞骨架有关。　　

　　值得注意的是，在HCC827GR5的治疗条件之间，克唑替尼的细胞内浓度差异显着，与克唑替尼单药治疗相比，联合治疗后的浓度显着增加。尽管我们只能假设这种增加会产生临床相关影响，但在我们的胰腺癌体内模型中，克唑替尼浓度的类似增加与相关的协同相互作用有关。　　

　　通过添加巴氟霉素，在所有治疗条件下克唑替尼的细胞内浓度均降至1pmol/μg蛋白。这表明克唑替尼被隔离在溶酶体中，并且该组合可能影响溶酶体隔离的过程。　　

　　这种效果可能是由细胞质和溶酶体，作为已经在MCF-7细胞系。两个隔室之间的pH差降低可能会导致Crzotinib在溶酶体中的螯合减少。厄洛替尼的添加可能会使pH值正常化，从而导致新的克唑替尼隔离。但是，用pH敏感探针pHrodoGreen进行的活细胞显微镜检查显示，亲代和HCC827GR5细胞系之间的基础pH值没有差异。此外，舒尼替尼在两种细胞系中均在溶酶体中积累，表明这两种细胞系都在进行溶酶体隔离。然而，在HCC827亲本细胞中克唑替尼处理后溶酶体的酸化可以解释克唑替尼在细胞中的较高细胞内浓度，而组合后的pH评估则很复杂，因为溶血示踪剂红色信号的面积大大增加，因为正在进行的细胞凋亡。这些综合结果表明，HCC827GR5细胞系中的pH值没有永久性变化，舒尼替尼和克唑替尼的溶酶体积累仍在发生。　　

　　我们结果的另一个解释可能是厄洛替尼对自噬的影响。几项研究表明，厄洛替尼和EGFR-TKI通常对自噬的诱导有影响。在EGFR突变的细胞和不依赖EGFR的细胞中均观察到了这种自噬的诱导。在自噬过程中，注定要分解的细胞室被膜包裹，并与溶酶体融合。接下来，溶酶体中的蛋白酶分解细胞室。已经显示出，由于溶溶同性化合物的积累，溶酶体的pH增加。反过来，溶酶体pH值的这种增加会阻止溶酶体蛋白酶的最佳功能，最终导致自噬受损。此外，溶酶体本身的积累足以激活自噬。　　

　　溶酶体积累后被激活的转录因子TFEB易位至细胞核并激活与溶酶体生物发生，自噬和胞吞作用有关的基因的表达。厄洛替尼与克唑替尼治疗的组合可能因此导致受损的自噬过程增强，导致细胞死亡增加。值得注意的是，以前的研究表明，自噬的增强与p-AMPK（Thr172）的增加和p-mTOR的降低有关。然而，我们的磷酸化数据显示，与单一疗法相比，联合疗法后HCC827GR5细胞系中p-AMPK的含量没有增加，而p-mTOR也没有大幅降低，这与这一假设相矛盾。　　

　　第三种解释可能是厄洛替尼与细胞骨架的结合干扰了微管追踪剂的溶酶体胞吐作用，与单一疗法相比，联合疗法后导致了细胞内克唑替尼Crizotinib的增加。但是，尚无研究详细确定厄洛替尼与细胞骨架的相互作用及其对微管支架的影响。详情请扫码咨询：