确定目标由mir-126-3-p可能影响扩散，侵袭性和响应的dabrafenib耐药细胞，我们集中我们的注意力在ADAM9(disintegrin和金属蛋白酶域9)，MMP7(矩阵metallopeptidase7)和PIK3R2(phosphoinositide-3-kinase调节亚基2)，三个miR-126-3p靶基因已经在黑素瘤细胞中验证，并显示参与黑素瘤侵袭性(ADAM9和MMP7)和获得性对BRAFi(PIK3R2)的耐药性。
我们还选择了CXCR4(C-X-C基序趋化因子受体4)，因为该基因被证明是结肠癌和甲状腺癌细胞中miR-126-3p的直接靶点，而CXCR4/CXCL12(C-X-C基序趋化因子配体12)轴已知可促进黑色素瘤细胞增殖和侵袭。
我们初步分析了这4个基因编码的蛋白在A375、A375R、SK-Mel28和SK-Mel28R细胞中的表达水平。在达拉非尼抗药细胞中，ADAM9表达上调，而PIK3R2表达水平相同，MMP7表达下调。SK-Mel28R细胞中CXCR4蛋白水平下调，但A375R细胞中没有。
基于这些结果，支持了ADAM9而非其他蛋白在达拉非尼获得性耐药中的作用，我们选择ADAM9进行进一步实验，评估pre-miR-126-3p转染A375R和SK-Mel28R细胞后，该蛋白是否下调。miR-126-3p替代显著抑制两种细胞系中ADAM9的表达。经100nMdabrafenib处理的A375和SK-Mel28亲代细胞中ADAM9表达也降低，这与该药物上调这些细胞中miR-126-3p的发现一致。
接下来，我们研究了通过特异性sirna直接靶向ADAM9是否可以降低A375R和SK-Mel28R细胞的增殖和/或增加达拉非尼的敏感性。
因此，用siADAM9或siCTRL转染这两种细胞系，转染24小时后用高浓度的达拉非尼孵育，5天后用MTT法检测增殖情况。Westernblotting检测细胞中ADAM9的表达。
在这两种细胞系中，siADAM9均降低了靶蛋白水平，显著抑制了增殖。达拉非尼处理对siCTRL/A375R细胞的增殖没有显著影响，而从200nM浓度开始，达拉非尼进一步降低了siADAM9/A375R细胞的增殖。siCTRL/SK-Mel28R和siADAM9/SK-Mel28R细胞对达拉非尼的反应表现出类似的行为，因为它们的增殖不受800nM药物浓度的影响，并受到更高浓度的刺激。
然而，siADAM9/SK-Mel28R细胞在各dabrafenib浓度下的增殖均显著低于siCTRL/SK-Mel28R细胞，且在800-1600nM药物浓度范围内，siADAM9/SK-Mel28R细胞的增殖均不超过dmso处理的siCTRL转染细胞。
接下来，我们评估了ADAM9是否参与调节达拉非尼Dabrafenib耐药细胞的侵袭能力。8f-g、8f-g、ADAM9基因敲低均显著抑制了A375R和SK-Mel28R细胞的侵袭能力。详情请扫码咨询：
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