达拉非尼Dabrafenib在A375R细胞中的敏感性

　　braf突变黑色素瘤靶向治疗的一个主要挑战是继发性耐药性的发展。虽然目前发现的大多数耐药机制涉及基因组改变，但越来越多的实验证据指出表观遗传和/或转录后机制在耐药的出现中发挥了相关作用。在此背景下，最近一些对敏感和匹配的BRAFi耐药细胞系的研究表明，后者细胞系中的miRNA表达模式发生了变化，并暗示了选定的miRNA参与调控细胞对BRAFi的反应。　

　　在本研究中，我们进一步探讨了miRNAs在黑色素瘤获得性braafi耐药中的作用。通过比较brafi敏感细胞系(即A375)及其达拉非尼耐药亚系(即A375R)的miRNA表达谱，我们鉴定出27个miRNA的表达在后者细胞系中显著改变。这些miRNAs可能与获得性耐药和/或我们之前发现的耐药细胞的某些生物学特性有关，即侵袭能力增强，VEGF-A和MMP-9分泌增加，ERK1/2和AKT活化过度。事实上，他们对富集KEGG通路的靶基因的注释确定了许多已经涉及调控细胞增殖和侵袭性和/或braafi抗性的通路，包括MAPK-和PI3K/akt信号通路。　　

　　在敏感细胞和达拉非尼耐药细胞中被鉴定为差异表达的mirna中，我们将注意力集中在miR-126-3p上，miR-126-3p在耐药细胞中显著下调。miR-126-3p(也被称为miR-126)及其补体miR-126-5p(也被称为miR-126*或之前的miR-123)来自同一miR基因，位于染色体9q24.3，位于表皮生长因子样结构域7(EGFL7)基因的内含子7内。大量实验研究表明，miR-126-3p除了调节血管生成和血管完整性外，还在包括黑色素瘤在内的多种肿瘤中发挥抑瘤作用，通过负性调控增殖、迁移和侵袭。　　

　　此外，Lin等人证实，在发育不良痣、原发性黑色素瘤和黑色素瘤转移中miR-126-3p水平逐渐降低，低表达miR-126-3p的原发性肿瘤患者5年总生存期更短。miR-126-3p的下调也参与了宫颈癌细胞对TRAIL的获得性耐药，以及胃癌细胞对长春新碱和阿霉素的获得性耐药。此外，miR-126-3p在药物治疗初期的非小细胞肺癌细胞、肾癌细胞或乳腺癌细胞中加强表达已被证明分别增加了对长春新碱和阿霉素、顺铂以及CDK4/6或PIK3CA抑制剂的敏感性。另一方面，关于miR-126-3p&5p在黑色素瘤耐药中的作用尚无数据。　　

　　在目前的研究中，我们首次展示mir-126-3-p是抑制黑色素瘤细胞的获得性耐药BRAFidabrafenib，恢复mir-126-3-p表达这些细胞促进细胞周期阻滞于G0/G1期，降低的水平磷酸化ERK1/2和/或一种蛋白激酶，并显著抑制增殖和侵袭性造成的。重要的是，耐药细胞中的miR-126-3p替换也影响了它们对达拉非尼的反应。具体来说，恢复miR-126-3p的表达显著提高了达拉非尼在A375R细胞中的敏感性，并取消了药物在SK-Mel28R细胞中的促进生长作用。此外，在A375R细胞中，miR-126-3p替代抵消了达拉非尼对侵袭能力的刺激作用。　　

　　同意的功能性角色miR-126-3-p下调BRAFi获得性耐药，我们发现dabrafenib诱导治疗老年病miR-126-3-p的A375SK-Mel28细胞而不是耐药同行，和执行表达式的米尔敏感细胞受损的扩散和延迟二级耐药性的出现在慢性接触毒品。综上所述，我们的数据表明，在braf突变型黑色素瘤患者中，BRAFi与miR-126-3p模拟物的结合可能代表了一种新的治疗方法，可以抵消耐药性的发展，并削弱肿瘤的生长和转移，使其对braafi无反应。尽管miRNA替代疗法仍存在一些挑战，但最近在晚期实体瘤和胸膜间皮瘤患者中进行的两项一期临床试验取得了令人满意的结果，突出了该方法的潜力。　　

　　在先前的研究中，肿瘤抑制和/或的chemosensitizing活动mir-126-3-p与down-modulation不同的目标基因，其中，例如，VEGFAPIK3R2在非小细胞肺癌和乳腺癌，IRS1在乳腺癌EZH2在胃癌SLC7A5在肾癌，CFLAR/c-FLIP宫颈癌，趋化因子受体CXCR4在结肠癌和甲状腺癌(42岁，46)。到目前为止，只有ADAM9、MMP7和PIK3R2被验证为药物treatment-naïve黑色素瘤细胞中miR-126-3p&5p的直接靶基因。　　

　　在本报告中，我们发现miR-126-3p在达拉非尼耐药黑色素瘤细胞中也能够下调ADAM9蛋白水平，这一分子事件参与了通过恢复miR-126-3p表达在耐药细胞中产生的生物学效应。事实上，ADAM9沉默可显著抑制细胞增殖和侵袭性。此外，它增加了达拉非尼对A375R细胞的敏感性，并抵消了药物对SK-Mel28R细胞的促生长作用。重要的是，在达拉非尼布敏感的A375和SK-Mel28细胞中，特异性sirna持续下调ADAM9水平，显著延迟了长时间暴露于药物后的耐药发作。因此，靶向ADAM9可能是提高BRAFi疗效的有效策略。　　

　　在本研究中，我们还发现转染pre-miR-126-3p的A375R和SK-Mel28R细胞中VEGF-A的分泌显著减少，并使用荧光素酶实验验证VEGF-A是达拉非尼耐药细胞中miR-126-3p的直接靶标。这些结果与之前报道的A375R和SK-Mel28R细胞表达较低水平的miR-126-3p，并与达拉非尼敏感细胞相比，分泌较高数量的VEGF-A的研究结果一致。除了ADAM9的下调外，VEGF-A的下调似乎也参与了miR-126-3p替代在耐药细胞中发挥的生物学效应。事实上，VEGF-A沉默几乎消除了A375R细胞的增殖和侵袭性。　　

　　值得注意的是，miR-126-3p替代诱导耐药细胞对细胞生长和ECM侵袭的抑制低于直接沉默VEGF-A引起的抑制。这可以解释为，抗VEGF-AsiRNA在降低VEGF-A表达方面比miR-126-3p替代更有效。在本文准备过程中，fatore等人证实vemurafenib获得性耐药黑素瘤细胞系中VEGF-A表达上调，并发现miR-199b-5p是该细胞因子的负调控因子。A375和A375R的miRNA表达谱并没有显示miR-199b-5p的差异表达。因此，似乎VEGF-A信号通路的激活是黑素瘤细胞在对BRAFi产生耐药性过程中收敛的一个共同特征，而这可以通过下调靶向miRs的不同VEGF-A来实现。　　

　　最近一项针对braf-突变黑色素瘤异种移植物的研究表明，braafiPLX4720与贝伐珠单抗联合使用在抑制肿瘤生长和转移方面比每一种单一药物都更有效，也能延迟获得性耐药的发生。由于贝伐珠单抗不能与小鼠VEGF-A结合，该研究强调了中和黑色素瘤细胞分泌的VEGF-A以提高BRAFi疗效的重要性。另一方面，已有研究表明，VEGF-A除了旁分泌和自分泌信号外，还可以介导脑内信号环路，促进肿瘤细胞的增殖、生存、侵袭和化疗耐药。因此，可以假设，通过将BRAFi与抑制癌细胞中VEGF-A表达的策略相结合，可以获得更好的抗肿瘤活性和更大程度的延迟继发耐药的发生。　　

　　在过去的几年里，越来越多的实验证据已经累计显示外周血所代表的“液体活检”可以是一个有用的生物样品的识别、非侵入性的方式，生物标志物(microrna即DNA，RNA，蛋白质)预测和监控对治疗的反应，并分析肿瘤治疗压力下进化。到目前为止，只有少数研究将循环细胞因子/趋化因子/生长因子作为患者对braafi或BRAF+MEKi治疗反应的潜在生物标志物。特别是，Wilmott等对24名接受达拉非尼、vemurafenib或达拉非尼Dabrafenib+曲美替尼治疗的患者进行了血清细胞因子谱分析，发现治疗前高水平的CCL2与较差的临床反应相关。　

　　相应地，Vergani等人在33名接受vemurafenib治疗的患者中发现，临床反应持续≤6个月的患者的治疗前CCL2水平高于反应持续至少2年的患者。最近，我们报道了大约70%的braafi或BRAF+MEKi应答患者和只有20%的无应答患者在治疗早期可以检测到血浆PTTG1蛋白的下降。在目前的研究中，我们表明，预处理(T0)和早期治疗(T2)血清VEGF-A水平显著高于没有回应治疗的病人中要比在实现CR患者或公关。此外，使用VEGF-A血清水平T0作为生物标志物，可以区分从non-responding患者治疗反应良好的敏感性和特异性。　　

　　尽管这些结果需要在更大的患者队列中进行验证，但循环VEGF-A水平似乎是一个易于测量的生物标志物，具有潜在的临床应用价值，可以预测和/或监测患者对braafi或BRAFi+MEKi治疗的反应。值得注意的是，在接受高剂量白介素-2或ipilimumab治疗的黑色素瘤患者中，血清VEGF-A水平的升高曾被证明与不良的临床反应和总生存期降低有关。此外，在黑色素瘤的临床前模型中，宿主免疫被发现有助于BRAFi的抗肿瘤活性。VEGF-A的免疫抑制活性，以及该细胞因子对肿瘤血管系统和黑素瘤生长和转移的直接影响，因此可能是高血清VEGF-A水平与对BRAFi和MEKi的不良临床反应相关的基础。详情请扫码咨询：