丙肝病毒的基因分型

　　研究人群　　

　　收集中国不同地区医院363例丙肝感染者的人血清，其中上海35例，陕西20例，天津19例，藏族62例，西藏23例，维吾尔146例，新疆42例，河北16例。研究人群的选择基于以下标准:巢式逆转录聚合酶链反应(巢式逆转录聚合酶链反应)证实血浆中存在丙肝RNA；没有其他伴随肝病；消极的HIV检测；既往未接受干扰素和/或利巴韦林治疗，无酗酒或静脉注射吸毒者。对照血清样本(n=3)取自A、B、C型肝炎、巨细胞病毒(CMV)和艾滋病毒(HIV)阴性的受试者。　　

　　Anti-丙肝ELISA　　

　　使用ELISA(Bio-Rad，Marne-La-Coquette，法国)对所有363份血清样本进行抗丙肝抗体筛选。测定结果以制造商推荐的测试样品的光密度与计算的截止吸光度的比值定量表示。血清标本OD值≥0.30为阳性，<0.30为阴性。对阳性和不确定的血清样本进行另一种ELISA检测，Innotest丙肝AbIV(InnogeneticsNV丙肝，Gand，Belgium)重新检测。两套ELISA检测均呈阳性时，均确认为抗丙肝抗体阳性。　　

　　中和抗丙肝抗体　　

　　中和实验使用ELISA，10μl复杂肽(CP1，CP2、NS4200μg/ml)被添加到90μl血清样本(1:10稀释在PBS)和孵化1h在37°C。每个血清样本10微升和与肽孵育的同一样本用丙肝ELISA检测。对每项来自内部对照的检测都建立了检测截止时间。先前检测的抗-丙肝阴性血液样本和稀释的缓冲液作为阴性对照。OD值降低50%表示阳性中和。不同地区或种族抗-丙肝中和率=(抗-丙肝中和阳性样本数/抗-丙肝阳性样本数)×100%。　　

　　丙肝病毒核糖核酸检测　

　　以提取的RNA为模板，采用嵌套式RT-PCR扩增丙肝10-115'utr(5'非编码区)特异性引物。PCR产物使用相同的循环程序重新扩增。每对引物均包括缺乏模板的阴性对照。如果一个对照被发现为阳性，那么该试剂盒中的所有PCR产物都被认为受到污染，并被丢弃。扩增的cDNA用2.0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色。　

　　丙肝病毒的基因分型　

　　利用基因型特异性引物扩增核心区域确定丙肝基因型，并区分基因型I、II、III和IV。用通用引物从丙肝cDNA中扩增出部分核心基因(272bp)。用通用引物和丙肝核心(丙肝-c)反义引物混合引物扩增部分产物，分别针对I、II、III和IV型。根据PCR产物的大小，4个基因型之间存在差异:基因型I为123bp；II为211bp；III240bp，IV188bp。　　

　　我国不同地区采集的人血清样本抗-丙肝中和率存在显著差异。河北地区样品中和率最高(87.5%)。上海、陕西、天津的检出率为中等，西藏、新疆的检出率较低。西藏62份血清样本中只有2份(3.2%)被丙肝复合抗原中和。　　

　　中和前，天津样品OD值最高(1.54±0.64)，西藏样品最低(0.66±0.26)。中和后，上海、陕西、天津和河北样品的平均OD值明显下降(下降50%或接近50%)，表明这些样品被显著中和。新疆维吾尔族样品OD值略有下降(下降约35%)，西藏藏族样品OD值略有下降(下降3.3%)。　　

　　西藏和新疆不同种族的血清样本中和前后的中和率和平均OD值存在显著差异。同一地区汉族的中和率高于其他种族，OD值的下降幅度大于同一地区其他种族。　　

　　丙肝病毒基因型　　

　　11例结果显示，丙肝基因型以II型为主(33/69，47.8%)，其次为II/III型(20/69，29.1%)。其他基因型则很少见。新疆维吾尔族丙肝基因型以I/II型为主(27/81，33.3%)，其次为I/II/III型(19/81，23.5%)和II型(14/81，17.3%)。　　

　　大多数I型样本(7/11，>60%)抗丙肝阴性。I型抗-丙肝阳性样本不能被本研究中使用的复合抗原中和。I型的平均OD值低于其他类型。大多数II型样本(42/47，>80%)抗丙肝阳性，部分样本可中和。II型样品的OD值较高，中和后明显下降。此外，同一基因型在不同地区采集的样品中中和率不同。例如，西藏的II型中和率远低于新疆。　　

　　维吾尔族多基因型(I/II/III)血清样本部分丙肝-C基因的克隆、测序与分析　　

　　克隆了1株多基因型(I/II/III)感染维吾尔族人的部分丙肝-C基因，随机选择重组克隆。确认和分型了142个阳性克隆。其中I型1个(0.70%)、II型85个(59.86%)、III型40个(28.17%)、II/III型14个(9.86%)和2个未分类基因型(1.41%)。II型基因型最为常见。5个克隆代表5种基因型的序列显示，本研究采用的丙肝基因分型方法可以明显区分I型、II型和III型。II型和III型基因型区分不清，因为II/III型克隆的序列与II型基因型更接近。未分类的丙肝基因型克隆序列也与II型相似。这5个克隆的DNA和氨基酸序列(未显示数据)存在差异，5个克隆的DNA序列同源性在85%~98%之间。详情请扫码咨询：