BCL2可强克唑替尼crizotinib触发的自噬通量

　　除了其在细胞凋亡的作用，BCL-2也是自噬的已知抑制剂已在下列药物治疗许多癌症被描述为影响细胞死亡机制的过程。由于我们最近表明 ALK 失活诱导自噬在 ALK 阳性 ALCL 细胞系中具有促生存特性，我们研究了伴随的 BCL2 升高是否可以解释这些条件下自噬过程的细胞保护功能。为了解决这个问题，我们生成了一个经过修饰的克隆 KARPAS-299 细胞系，该细胞系用编码 LC3 蛋白（微管相关蛋白 1 轻链 3）的转基因稳定转染，LC3 蛋白是自噬体的早期标志物，与 RFP 和 EGFP 偶联。这种串联荧光标记的 LC3 报告蛋白的表达使流式细胞仪定量和基于共聚焦显微镜的自噬通量分析成为可能。

　　根据我们之前的研究，我们观察到克唑替尼（crizotinib）以剂量依赖的方式诱导自噬通量，表现为高 RFP/EGFP 荧光比的细胞百分比增加。更重要的是，在与BCL2在自体吞噬下调的已知功能，保持我们发现，BCL2击倒，要么使用siBCL2或 miR-34a 模拟物，显着增加了具有高 RFP/EGFP 比率的细胞百分比，表明自噬通量更高，这在基础和克唑替尼治疗条件下均观察到。我们通过进行其他两项测定来监测和量化 KARPAS-299 全细胞群和其他两种 ALK 阳性 ALCL 细胞系中的自噬通量，证实了这些结果。总而言之，我们的结果强烈表明，BCL2 在抑制 ALK 阳性 ALCL 中基础和克唑替尼诱导的自噬通量方面起着关键作用。

　　为了阐明联合克唑替尼治疗和 BCL2 下调后自噬通量的这种显着增加是否可能与在相同条件下观察到的细胞活力丧失增加有关，我们跟踪了自噬机制因 ULK1 敲低而受损的细胞的存活情况，一个参与自噬过程早期阶段的关键因素。在存在或不存在克唑替尼的情况下，用针对 ULK1 mRNA (siULK1) 和/或针对 BCL2 mRNA (siBCL2) 的 siRNA 转染34 个mRFP-EGFP-LC3 KARPAS-299 细胞。ULK1 敲低有效地阻止了自噬过程，正如黄色（反射自噬体）和红色（反射自噬溶酶体）点状染色的减少所揭示的那样。

　　自噬通量的流式细胞术监测首先证实，在未处理和克唑替尼处理的细胞中，BCL2 表达的阻断增加了表现出高度自噬的细胞数量。其次 ULK1 下调成功阻断了自噬机制，因为它降低了基础自噬水平并抑制了在 BCL2 敲低细胞中观察到的克唑替尼触发的自噬通量（减少了 2 倍）。最有趣的是，MTS 活力测定表明，在克唑替尼处理的细胞中，BCL2 下调进一步降低细胞活力的影响被 ULK1 的敲低完全逆转。这些结果强烈表明，克唑替尼治疗后 BCL2 下调增强了自噬通量，这对 ALK 阳性 ALCL 细胞有害，从而导致在这些条件下更大的活力损失。

　　为了解决我们模型中自噬通量的增强是否足以触发细胞死亡的问题，我们接下来用克唑替尼和雷帕霉素（一种众所周知的 mTOR 抑制剂和自噬强诱导剂，即 ALK 阳性）的组合进行了实验。肿瘤细胞。我们首先证实单独使用雷帕霉素 (100 nM) 确实在 KARPAS-299 细胞中诱导自噬，因为在处理 24 小时和 48 小时后，分别有 60% 和 75% 的细胞具有高自噬通量。然后我们观察到，克唑替尼和雷帕霉素联合治疗导致自噬通量明显增强，在我们的测定中使用最低剂量的克唑替尼 (125 nM) 获得更显着的效果。我们还发现自噬通量的这种增强与细胞活力的降低有关，如通过 MTS 比色测定所测量的。治疗 48 小时和 72 小时后效果更明显。然而，Annexin-V/PI 染色显示，当单独使用克唑替尼治疗与克唑替尼和雷帕霉素联合治疗时，发生凋亡细胞死亡的细胞数量没有显着差异，与使用的克唑替尼剂量和治疗持续时间无关。总而言之，这些结果表明，克唑替尼和雷帕霉素联合治疗时过度自噬会导致细胞死亡，而与细胞凋亡无关。现在克唑替尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。