EGFR介导的细胞系和患者样品中对克唑替尼/赛可瑞的耐药性

　　H3122 CR3细胞不具有继发性ALK突变或EML4-ALK基因扩增，因此对ALK抑制和hsp90抑制均具有抗性。克唑替尼对该细胞系的治疗与敏感的亲代细胞相同程度地抑制了ALK的磷酸化。然而，尽管存在ALK抑制作用，但在存在克唑替尼（赛可瑞），表明这些途径是由ALK以外的其他监管机构维持的。从其他癌基因依赖范式研究提示的替代的RTK活化可能导致对激酶抑制剂。为了解决这种可能性，我们使用磷酸RTK阵列评估了克唑替尼对H3122和CR3亲本细胞中42种磷酸RTK的作用。与亲代细胞相比，H3122 CR3细胞在克唑替尼治疗前后均含有较高水平的磷酸化EGFR和磷酸化ERBB3。直接针对磷酸化EGFR和磷酸化ERBB3的免疫印迹证实了这一发现。我们没有检测到可能在H3122 CR3细胞中激活EGFR的EGFR突变或基因扩增。然而，定量逆转录-PCR（RT-PCR）显示耐药细胞中EGFR mRNA以及EGFR配体双调蛋白和ERBB3配体NRG1上调。因此，H3122 CR3细胞中的EGFR激活可能是由于受体本身以及两个配体的上调引起的，从而导致下游信号级联反应的持久性不依赖于ALK的激活。

　　为了确定增加的ERBB信号是否可能是H3122 CR3细胞获得的克唑替尼耐药性的基础，我们用克唑替尼，吉非替尼（EGFR TKI）或其组合处理了细胞。尽管H3122 CR3细胞仅对克唑替尼或吉非替尼具有抗性，但联合治疗可抑制AKT和ERK磷酸化并导致了显着的增长抑制。但是，尽管抑制了下游信号传导途径，但H3122 CR3细胞对克唑替尼和吉非替尼（或厄洛替尼）的组合仍然比单独使用克唑替尼处理的亲本H3122细胞敏感。为了确定缓解的反应是否可能表明H3122 CR3细胞无法响应克唑替尼和吉非替尼的联合治疗而发生凋亡，我们对亲代和耐药细胞进行Annexin V染色。克里替尼处理H3122亲本H3122细胞会在72小时后诱导明显的细胞凋亡，而克里奥替尼，吉非替尼或两者的组合治疗H3122 CR3细胞则无法诱导凋亡。为了研究这一发现的分子基础，我们研究了蛋白质和BIM的mRNA水平，在癌症嗜激酶。尽管BIM蛋白在联合克唑替尼和吉非替尼处理的H3122 CR3细胞中似乎被去磷酸化并上调，但BIM的上调远低于单独用克唑替尼处理的H3122亲本中观察到的BIM的上调。因此，在H3122 CR3细胞中BIM mRNA较低。这与我们最近的发现一致，即BIM mRNA可能解释了不同的BIM蛋白水平以及致癌基因上瘾的癌症发生凋亡的不同潜力。总之，这些结果表明，尽管EGFR激活可能介导获得性克唑替尼耐药性，但EGFR激活不能完全解释获得性耐药表型，并且在克唑替尼耐药性疾病中联合应用ALK和EGFR激酶抑制作用可能不如克唑替尼治疗克唑替尼敏感疾病。

　　这些体外发现促使我们确定是否有证据表明EGFR活化是患者标本中的一种耐药机制。因此，我们检查了18例克唑替尼复发的ALK阳性患者的耐药性肿瘤。根据磷酸化EGFR的免疫组化（IHC）染色，我们在除了一个具有足够组织进行IHC分析的组织的耐药标本中，在所有抗性标本中检测到了EGFR激活（1+至2+染色）。在9例病例中，我们能够将抗药性肿瘤标本与克唑替尼治疗前获得的原始诊断标本进行比较。在这9例病例中，有4例与相应的敏感样品相比，在抗药性中检测到了EGFR激活增加，支持EGFR在调解克唑替尼耐药性中的可能作用。此外，在四例有EGFR激活证据的病例中（MGH021）也有继发性ALK突变。因此，单一患者的抗药性机制可能不止一种，这可归结为克唑替尼抗药性的发展，概括了在H3122细胞系模型中观察到的抗药性机制的异质性。

　　出乎意料的是，我们检测到除一个预处理标本外的所有标本中的EGFR激活。这些病例均未发现激活的EGFR突变。的确，与最近的一项报道50名未接受克唑替尼的患者中的3名同时存在ALK重排和EGFR突变的研究相反，我们发现103例ALK阳性患者和214例EGFR突变阳性患者之间没有重叠病例。因此，在未曾出现克唑替尼，ALK阳性的NSCLC的情况下，EGFR激活不太可能是EGFR突变的结果。

　　鉴于我们在未治疗的癌症标本中观察到了很大比例的EGFR磷酸化，因此我们希望确定EGFR活化在对克唑替尼敏感的疾病中是否在功能上很重要，并可能减轻对克唑替尼的初始反应。在H3122细胞中，添加EGFR抑制剂不会增加克唑替尼。但是，我们研究了另一种细胞系MGH006，该细胞系来自我们先前报道的未曾患有克唑替尼的晚期ALK阳性NSCLC的患者。在细胞存活试验中，MGH006细胞对克唑替尼敏感，但不如H3122细胞敏感。与抗性H3122 CR3细胞相似，MGH006细胞表达高水平的磷酸化和总EGFR蛋白。与单独的克唑替尼相比，用克唑替尼和吉非替尼联合治疗MGH006细胞可显着抑制下游AKT和ERK磷酸化。特别地，抑制ERK信号传导途径需要同时抑制该细胞系中的ALK和EGFR。联合的ALK和EGFR抑制作用还导致更有效的生长抑制和明显的凋亡诱导。总之，这些结果表明，即使对于未曾使用克唑替尼的患者，EGFR活性也可能有助于维持下游信号传导，从而降低了单药克唑替尼的疗效。现在克唑替尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。