关于ALCL细胞系克唑替尼/赛可瑞敏感性的基因

　　要定义行驶阻力以高通量的方式来克唑替尼(赛可瑞)的潜在机制，我们建立了基于CRISPR过表达系统在ALCL细胞系。转录上调是通过将VP64直接融合到无催化作用的Cas9（dCas9）上并进一步募集转录激活域p65和HSF1，最终募集转录机制到所需靶基因的转录起始位点来实现的。

　　使用该系统，我们首先上调了三磷酸腺苷结合盒亚家族B成员1的表达，该转运蛋白在肝脏和血脑屏障中表达，对外排有毒物质表达，先前已显示出对克唑替尼耐药在ALK+NSCLC中。我们能够提高克唑替尼的4种ALK+ALCL细胞系中的3种的IC50，但不能增加ALK-ALCL细胞系的IC50，这证实了对克唑替尼的敏感性很容易操作。

　　为了测试CRISPR过表达系统在ALCL细胞系中的效率，我们使用了一组针对15个基因的sgRNA，这些基因先前已显示在EML4-ALK+NSCLC中导致克唑替尼耐药。大多数sgRNA达到显着过表达的能力高度依赖细胞系。因此，我们使用基于CRISPR的过表达平台，在全基因组sgRNA文库中筛选了3种ALCL细胞系（K299 / SUP-M2 / DEL）中对克唑替尼耐药的潜在驱动因素，该文库中的全基因组sgRNA文库包含靶向23430个基因的70290个sgRNA。用文库转导表达dCas9-VP64 / MS2-P65-HSF1的ALCL细胞，并在zeocin中选择7天（第0天）。接下来，我们将选择的细胞暴露于克唑替尼/ DMSO中14天。在第0天和第14天从细胞中分离出gDNA，并进行深度测序以测量每个sgRNA的读取计数。处理后，使用MAGeCK评估每个sgRNA的丰度变化，并进行质量控制分析。我们确定了在14天的克里唑替尼富集基因的宿主与天14 DMSO处理的细胞，包括基因的已知相关性疾病ALCL生物学，如STAT3 / RORC / MYC / IRF4相比。

　　STAT3，NPM1-ALK的公知的下游介质，是在所有3 CRISPR过表达屏幕上的最显著富集基因，从而证实了这种方法的有效性。此外，NPM1在屏幕中也显着丰富。我们选择了≥2个ALK+ALCL细胞系之间共享的10个最显着富集的基因，以进行进一步验证。首先，我们在4个ALK+和1个ALK-ALCL细胞系中每个基因使用2个sgRNA，过表达这10个候选基因以及NPM1作为阳性对照。确定过表达水平（补充图1I）后，使用48小时CellTiter-Blue细胞活力测定法评估存在克唑替尼时的生长抑制作用。在所有ALK+细胞系中改变克唑替尼敏感性的最一致的靶标是白介素10受体亚基α（IL10RA）和腺苷A2a受体（ADORA2A）。

　　接下来我们推断，如果基因的过表达会降低对克唑替尼的敏感性，那么敲除同一基因应会增加对克唑替尼的敏感性。为了解决这个问题，我们针对相同的10个候选基因进行了迷你CRISPR敲除筛选。TS / K299细胞用每个基因包含6个sgRNA的GeCKO v2小型文库进行转导，并用嘌呤霉素选择7天（第0天），然后再暴露于克唑替尼/ DMSO 14天，并按照先前进行的过表达筛选处理。IL10RA / PGBD1的敲除使TS细胞系对克唑替尼更敏感，但对K299细胞系却不敏感。

　　平行地，分析了相同的10个候选基因在长期暴露于ALK TKIs（克唑替尼/ 阿来替尼/ 布加替尼/ 劳拉替尼）中以诱导耐药性的细胞中的表达水平并与亲代细胞的转录水平进行了比较。在评估的基因中，IL10RA在30％的耐药细胞系中过表达。现在克唑替尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。