为了确定在患者体内产生的克唑替尼（crizotinib）耐药机制，我们对18名在克唑替尼上复发的晚期ALK阳性NSCLC患者进行了活检。与获得性耐药的其他研究有针对性的治疗一致，所有18例ALK阳性非小细胞肺癌最初回应克里唑蒂尼通过计算机断层扫描。克唑替尼治疗的持续时间为4到34个月，中位数为10.5个月。大多数患者（18名患者中的15名）在仍接受克唑替尼治疗或停用克唑替尼的1个月内进行了再次活检。肿瘤标本取自核心活检或切除，纵隔淋巴结样本或恶性胸腔积液。所有18个耐药性肿瘤样本均具有腺癌组织学。
除三个组织外，由于组织有限，在所有抗性标本中通过荧光原位杂交（FISH）证实了抗性病变中的ALK重排。在检查的15例病例中，有1例ALKFISH显示了高水平的基因扩增。没有ALK抗性突变在这个标本被发现了，所以会出现野生型的高级放大ALK融合基因是足以引起阻力。这一发现与我们先前在H3122细胞中的观察结果一致，即野生型EML4-ALK的扩增会引起对克唑替尼的耐药性。
我们确定是否有任何抗药性癌症在ALK中发生了突变，这些突变可能是其抗性表型的基础。我们从每个抗药性病例中提取了总核酸，并对与ALKTK结构域相对应的外显子20至28进行了测序。在7种情况下，可获得新鲜冷冻的样品，并从互补DNA（cDNA）扩增了ALK的整个激酶结构域或整个EML4-ALK并进行了测序。在18位耐克唑替尼的患者中，我们确定了4位（22％）具有耐药突变：3个错义突变（L1196M，G1202R和S1206Y）和氨基酸（苏氨酸）插入突变。我们通过将扩增的聚合酶链反应（PCR）产品亚克隆到pCR4载体中并对单个细菌菌落进行测序来确认这些突变的存在。
为了确定抗药性样本中是否从头出现了ALK突变，我们从具有抗药性突变的四名患者中的三名（MGH011，MGH020和MGH021）中获得了克唑替尼治疗前的样本。我们从每个前克唑替尼样品中制备了总核酸，并通过标准Sanger测序对ALK TK结构域进行了测序。没有ALK在相应的克唑替尼前样品中鉴定出了在抗性样品中发现的突变。为了进一步证实这些发现，我们使用了等位基因特异性PCR分析法来检查患者MGH020的前克唑替尼样品是否含有低水平的L1196M。我们先前开发了此检测方法来检测网守L1196M突变，并表明该检测方法具有0.3％或更低的检出限，具有很高的敏感性。使用该测定法，我们在抗性MGH020标本和具有EML4-ALK的细胞系L1196M（H3122 CR1）中鉴定了L1196M，但在与MGH020相对应的前克唑替尼样品中未鉴定出L1196M。这些结果表明，ALK在克唑替尼治疗之前，在克唑替尼耐药情况下确定的突变在肿瘤中并不普遍。
根据ALK的晶体结构，所有四个已鉴定的突变都聚集在ALK（ATP）结合口袋附近。L1196M氨基酸取代等效于在EGFR（T790M）和BCR-ABL（T315I）中观察到的分别赋予吉非替尼和伊马替尼耐药性的网守突变。这种突变在谁曾在克里唑蒂尼和性的细胞系模型。在这三个新突变中，G1202R突变类似于对伊马替尼耐药的BCR-ABL突变（G340W），该突变通过随机诱变筛选得以鉴定，但尚未在患者样本中报告。其他两个突变（1151T插入和S1206Y）似乎是ALK和克唑替尼耐药性所特有的。G1202R和S1206Y都位于与克唑替尼结合位点邻接的激酶结构域的溶剂暴露区域（即溶剂前沿）中，并且可能会降低克唑替尼对突变体ALK的亲和力。相比之下，预计1151Tins残基位于α螺旋C。该位置与克唑替尼结合位点不相邻，以前的研究表明该突变可能会影响ALK对ATP的亲和力（请参见讨论）。这种突变导致对克唑替尼的抗药性很高。
为了直接确定这些突变是否赋予对克唑替尼的抗性，我们对Ba / F3细胞进行了工程改造以表达带有每个突变的EML4-ALK，并检查了克唑替尼治疗后的细胞存活率。如先前报道的时，网守L1196M突变赋予高水平的耐克里唑替尼。我们还发现，G1202R和S1206Y溶剂前沿突变和1151Tins突变也赋予了对克唑替尼。接下来，我们检查了存在或不存在每种抗药性突变时，克唑替尼对ALK磷酸化的影响。
与Ba/F3结果一致，克唑替尼在抑制EML4-ALK带有四个抗性突变中的任何一个的磷酸化方面效果较差。尽管这些突变足以引起对克唑替尼的耐药性，但这些ALK突变与克唑替尼耐药性的不同程度相关。特别是，在这四个突变中，S1206Y赋予对克唑替尼的耐药性最低，而L1196M，G1202R和1151Tins赋予克唑替尼更高的耐药性。克唑替尼耐药性的这些差异可能会在耐药性产生后最终影响患者的临床病程，以及未来尝试通过增加患者克唑替尼血浆浓度来克服耐药性的策略的成功。现在克唑替尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。
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