卡博替尼Cabozantinib的药效性研究

　　卡博替尼（Cabozantinib）和雷戈非尼治疗后，通过18-氟-脱氧葡萄糖正电子发射断层显像（FDG-PET）测量葡萄糖摄取。在2种CRC PDX模型（CRC098和162）上进行了FDG-PET研究，以确定治疗是否改变了葡萄糖的摄取。在基线（治疗之前）以及在用卡巴替尼或雷戈非尼治疗后的第7天和第28天对动物进行扫描。小鼠禁食4小时，并通过尾静脉注射150μCi（5.55 MBq）的18F-氟脱氧葡萄糖（FDG，通过PetNet获得）。进行。首先，执行快速CT扫描以进行解剖定位。然后，将床移至μPET扫描仪中。所有PET扫描均以双采样模式获取，以提高空间分辨率（1.2毫米）。西门子Inveon工作站研究（IWR v3）进行了PET / CT图像融合，以精确解剖识别感兴趣区域（ROI）。在肿瘤病变内手动绘制感兴趣区域，并确定ROI的总放射性（以kBq / mL为单位）。SUV是按照我们小组和其他人的描述计算的。所有PET / CT扫描均在UCCC动物影像共享资源（AISR，N。Serkova）处进行。

　　使用RNAeasy试剂盒（Qiagen）提取在治疗第3天来自卡博替尼治疗的CRC外植体的总RNA。RNA Seq用于确定对照小鼠和治疗小鼠肿瘤中的基因表达。原始表达值已获得，并通过Affymetrix Power Tools基于多阵列平均值进行标准化。代表同一基因的多个探针组以最大值折叠。为了评估对照和卡博替尼处理的外植体中富集的途径，

　　使用Qiagen组织裂解仪将对照和治疗的肿瘤标本（15 mg /肿瘤组织）均质化。在冰上10分钟后，将裂解的组织在4℃以16,000g离心10分钟。使用660 Protein Assay试剂盒定每个样品中的蛋白质定量。在预制的4–12％Bis-Tris凝胶（Life Technologies）上对总共50μg的样品进行电泳。然后使用iBlot转移系统（Life Technologies）将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。使用3％酪蛋白在室温下将膜封闭1小时。封闭后，将膜与以下一级抗体（1：1,000）在4°C下摇动过夜：（磷酸化和总计：MET，AKT，己糖激酶，丙酮酸脱氢酶，ULK1，ATG3，Beclin，LC3，SQSTM / p62和肌动蛋白（细胞信号技术）。用TBST洗涤3次后，将膜与抗兔IgG（H + L）二抗在室温下孵育1小时，最终稀释度为1：15,000。使用Odyssey红外成像系统（Li-Cor）捕获信号图像。

　　使用Qiagen组织裂解仪将对照和处理过的肿瘤标本（15 mg /肿瘤组织）均质化，并使用660 Protein Assay试剂盒对蛋白质进行定量。将含有39抗体/孔的载玻片（RTK阵列； Cell Signaling Technologies）封闭15分钟后，将50μg蛋白加入到载玻片中，并在4°C温和摇动孵育过夜。然后洗涤载玻片，并向载玻片中添加检测抗体，然后加入DyLight 680VR连接的链霉亲和素。使用Odyssey红外成像系统（Li-Cor）捕获幻灯片图像，并使用Odyssey系统软件对其进行定量。

　　使用CYTO-ID®自噬检测试剂盒（Enzo -ENZ-51031-K200）在HCT116和HT29细胞系上评估了卡博替尼，雷戈非尼和克唑替尼对自噬的治疗效果。将HCT116或HT29细胞以1,000个细胞/孔的浓度接种在96块黑色壁板中。24小时后，将细胞用卡博替尼（5μM），瑞戈非尼（5μM）和克唑替尼（1μM）处理。孵育24小时后，将细胞用1x分析缓冲液洗涤2次，然后与CYTO-ID®自噬检测试剂一起孵育30分钟。30分钟后，将细胞用1x分析缓冲液洗涤2次。使用488nm激发绿色荧光检测在IncuCyte™ZOOM活细胞成像仪上评估了治疗效果。

　　接下来，我们在体外进行与自噬抑制剂氯喹和/或SBI-0206965（ULK1抑制剂）在HCT116和HT29 CRC细胞上的联合研究。将细胞以1,000个细胞/孔的浓度接种在96黑孔板中，并孵育过夜以使细胞粘附。24小时后，除去培养基，并向每个孔中添加100 ul含有IncuCyte™动力学Caspase-3 / 7细胞凋亡测定试剂（目录号4440）的培养基。用卡博替尼（5μM），SBI-0206965（5μM），氯喹（10μM），卡博替尼（5μM）加SBI-0206965（5μM）和卡博替尼（5μM）加氯喹（10）处理细胞后立即（μM）。此外，将瑞戈非尼（5μM）或克唑替尼（1μM）用作单一药物，并与SBI-0206965（5μM）组合使用。现在卡博替尼的仿制药价格是多少？更多详情可咨询下方微信。