托法替尼托法替布是JAK家族激酶成员的选择性抑制剂

　　Tofacitinib是JAK家族激酶成员的选择性抑制剂，对JAK1和JAK3>>>JAK2>酪氨酸激酶2(TYK2)具有很强的选择性。通过抑制JAK磷酸化，托法替尼通过激活的JAK1抑制下游STAT家族成员的募集，从而中断这些信号级联，从而减少炎症基因的STAT依赖性激活）。托法替尼已被证明是治疗多种慢性炎症疾病的有效治疗剂，并已被FDA批准用于治疗类风湿性关节炎、银屑病，以及最近的溃疡性结肠炎。在2期临床试验中，每天两次接受10毫克托法替尼治疗的UC患者在52周时出现缓解率高达40.6%，而安慰剂组为11.1%。与此同时，45.7%的托法替尼患者在52周时发生粘膜愈合，而接受安慰剂的患者为13.1%。尽管本研究的主要终点之一是粘膜愈合，但托法替尼对构成肠道屏障的关键粘膜细胞类型的直接影响尚不清楚。　

　　托法替尼对IFN-γ诱导的屏障功能障碍的保护作用。在炎症过程中，细胞因子如IFN-γ被释放并与其上皮细胞上的受体结合，JAK1蛋白相互靠近并被激活。这些反过来磷酸化充当STAT蛋白对接位点的细胞因子受体，然后由JAK1蛋白激活。磷酸化的STATs形成二聚体，易位到细胞核，并作为特定基因的转录因子，如claudin-2。IFN-γ处理后，claudin-2表达上调，ZO-1错误定位以形成细胞间间隙。作为一种小分子抑制剂，当托法替尼与JAK蛋白的ATP结合位点结合时，信号级联的第一步停止，在这项研究中，我们表明托法替尼通过抑制细胞因子诱导的JAK1-STAT1/3激活对体外IEC产生直接影响。针对最大JAK1或STAT1/3磷酸化优化了IFN-γ暴露的时间，托法替尼将IFN-γ刺激的pJAK1、pSTAT1和pSTAT3降低至与对照相当的水平。此外，托法替尼不仅能够防止由IFN-γ引起的通透性增加，而且还能从IFN-γ诱导的屏障通透性增加中拯救上皮单层。　　

　　在IFN-γ攻击之前用托法替尼治疗IEC可防止TER和FD4通透性增强的显着降低。这表明托法替尼在暴露于促炎介质之前对JAK的抑制足以维持屏障的完整性。这可能与托法替尼在疾病活动爆发开始时潜在地限制新分泌的炎性细胞因子对上皮屏障破坏作用的临床疗效有关。托法替尼挽救原代人结肠样体中由IFN-γ引起的通透性缺陷的能力进一步支持了托法替尼对肠上皮的直接有益作用的证据。人类类结肠在3维方向生长时更好地概括了IEC的微环境，从而保留了结肠隐窝上皮细胞亚型的结构和多样性。托法替尼挽救原代人结肠样体中由IFN-γ引起的通透性缺陷的能力进一步支持了托法替尼对肠上皮的直接有益作用的证据。　　

　　人类类结肠在3维方向生长时更好地概括了IEC的微环境，从而保留了结肠隐窝上皮细胞亚型的结构和多样性。托法替尼挽救原代人结肠样体中由IFN-γ引起的通透性缺陷的能力进一步支持了托法替尼对肠上皮的直接有益作用的证据。人类类结肠在3维方向生长时更好地概括了IEC的微环境，从而保留了结肠隐窝上皮细胞亚型的结构和多样性。值得注意的是，尽管用于细胞培养研究的相同浓度的托法替尼能够挽救结肠样体中由IFN-γ引起的FD4通透性增加，但在结肠样体中的暴露时间比细胞系更长。总的来说，这些数据表明托法替尼使用两种上皮模型系统挽救了屏障功能，从而进一步验证了该药物在使屏障功能正常化方面的功效。　　

　　我们试图区分由特定紧密连接变化调节的2种主要渗透率形式，即由TER（孔通路）测量的电解质通量的大小和电荷选择性以及大小但非电荷选择性渗透率的特征为FD4渗透性（泄漏途径）。虽然泄漏通路的增加也可能导致TER的减少，但渗透性的这一功能参数通常与密蛋白家族蛋白表达的变化相关，密蛋白2的表达增加直接导致TER减少，因为通量增加Na+和水。我们之前证明STAT1结合是IFN-γ诱导的claudin-2启动子活性增加的部分原因，并且STAT结合域的突变消除了IFN-γ诱导的CLDN2启动子活性。我们目前的数据表明，托法替尼对claudin-2上调的抑制作用至少部分归因于对CLDN2启动子的抑制。与我们之前的发现一致，这种抑制作用可能是由于STAT1介导的claudin-2转录减少，因为STAT1是激活的JAK1的底物。尽管我们之前已经证明STAT1与CLDN2启动子结合以通过STAT结合基序增加CLDN2表达，但其他STAT（特别是STAT6）参与炎症细胞因子IL-13对claudin-2表达的调节也已被证明。　　

　　然而，我们的数据确实与先前的研究形成对比，表明STAT1的药理学抑制剂无法减轻IFN-γ诱导的TER减少。来自同一组的数据表明，在IFN-γ治疗后，STAT1促进STAT5b活化，它与FynSrc激酶和PI3-激酶形成复合物，作为IFN-γ诱导的屏障功能障碍的介质，特别是大分子辣根过氧化物酶易位在T84单层。这些研究强调了STAT蛋白如何在屏障功能调节中发挥多功能和复杂的作用，这可能是上下文相关的。　　

　　IFN-γ是公认的occludin和ZO-1紧密连接定位和表达的调节剂。在本研究中，我们没有观察到ZO-1、阻塞或MARVEL跨膜蛋白家族的另一个成员在IFN后的表达水平上有显着差异-γ处理24小时。这表明IFN-γ诱导的FD4通透性增加——因此托法替尼对FD4的正常化作用——可能不是由ZO-1、occludin或tricellulin的整体蛋白质表达的变化介导的。相反，托法替尼对FD4通透性的抑制作用可能是由于紧密连接蛋白定位的变化。ZO-1重定位数据和ZO-1免疫荧光染色在托法替尼处理的细胞单层中观察到的细胞间间隙频率降低支持了这一点。事实上，如前所述，IFN-γ诱导的屏障通透性和紧密连接蛋白重新定位的改变可能部分是由于这些紧密连接蛋白从质膜重塑或内化到根尖下细胞质区室。　　

　　我们的研究还表明，在暴露于IFN-γ期间对托法替尼进行早期干预可以完全挽救FD4通透性的增加，但只能部分缓解TER的下降。这种部分恢复与我们的发现相关，即在救援方案研究中，claudin-2蛋白表达水平没有恢复到未处理和DMSO处理的对照。一个潜在的解释可能是，托法替尼无法完全逆转导致claudin-2和TER损失增加的信号事件序列，而不是其明显能够阻止靶向泄漏屏障缺陷中涉及的连接蛋白的信号模式，从而逆转增加由IFN-γ引起的FD4通透性。　　

　　与其他研究中使用的浓度相比，此处用于研究屏障和JAK/STAT信号对IEC影响的托法替尼浓度相对较高。例如，30nM和100nM的托法替尼/托法替布分别降低了CD4+T细胞和成纤维细胞样滑膜细胞中细胞因子诱导的STAT1磷酸化。然而，这种差异可归因于所研究的不同细胞类型，因为根据我们的经验，肠上皮细胞系对炎性细胞因子或药理学抑制剂的敏感性不如其他细胞类型。最低剂量2μM的托法替尼在IEC单层中没有对IFN-γ产生屏障保护作用，这表明在该实验系统中，需要更高浓度的托法替尼来调节读数中的下游效应器反应，例如屏障功能。然而，值得注意的是，在我们的研究中，托法替尼以2.6mg(16.7μM)或7.8mg(50μM)给药，这在给予溃疡性结肠炎患者5或10mg的剂量范围内。详情请扫咨询：