如何降低肺癌细胞对吉非替尼(Gefitinib)的耐药几率

　　表皮生长因子受体 (EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 吉非替尼（Gefitinib）已在非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者中显示出显着的临床疗效。然而，其治疗功效最终受到获得性耐药性的发展的限制。本研究的目的是探索染色体区域维持 1 (CRM1) 抑制剂细霉素 B (LMB) 联合吉非替尼克服 NSCLC 细胞中原发性和获得性吉非替尼耐药性的潜在效用。通过MTT评估吉非替尼和LMB的联合作用，并通过流式细胞术和Western印迹评估其强调机制。LMB 在 A549 中对吉非替尼诱导的细胞毒性显示出协同作用（IC50：25.0±2.1 μM 吉非替尼 + LMB 对比 32.0±2.5 μM 单独吉非替尼，p<0.05）。与吉非替尼相比，吉非替尼+LMB 引起了显着不同的细胞周期分布和涉及EGFR/存活蛋白/p21 的信号通路。然后在 10 个月内用逐渐增加的吉非替尼 (A549GR) 浓度或与 LMB (A549GLR) 组合处理 A549 细胞，以产生吉非替尼耐药性。吉非替尼在 A549GLR 中的 IC50 (37.0±2.8 μM) 显着低于 A549GR (53.0±3.0 μM, p<0.05)，表明 LMB 可以逆转 A549 中吉非替尼诱导的耐药性。进一步的机制研究表明，A549、A549GR 和 A549GLR 中 EGFR 通路和上皮间充质转化 (EMT) 标志物的表达模式存在显着差异。

　　在这项研究中，我们通过显着增加前 G1 期的细胞周期分布证明了 LMB 对吉非替尼（Gefitinib）诱导的细胞毒性的协同作用。进一步的蛋白质印迹分析揭示了在用吉非替尼或吉非替尼 + LMB 处理 48 小时的 A549 中 EGFR 通路、存活蛋白和 p21 的独特表达模式。更重要的是，10个月的吉非替尼+LMB联合治疗可以显着降低A549中吉非替尼耐药的发展。还观察到 A549GR 和 A549GLR 的特性在集落形成、迁移和侵袭能力方面与 A549 不同。在集落形成试验中，A549GLR 与 A549 和 A549GR 相比集落数显着减少，但 A549GLR 的集落大小显着大于 A549 和 A549GR。在伤口愈合和 Transwell 检测中，A549GR 和 A549GLR 显示出明显高于 A549 的迁移和侵袭能力。A549、A549GR 和 A549GLR 的蛋白质和 mRNA 谱显示，A549GR 和 A549GLR 中 EGFR 通路、EMT 和 CSC 生物标志物的表达有显着差异。

　　包括我们在内的多项研究表明，CRM1抑制剂LMB可以显着增强治疗药物的细胞毒作用，有效降低癌细胞的耐药性。例如，据报道短期 LMB 治疗可增强 TKI 伊马替尼治疗 Bcr-Abl 阳性白血病的作用，伊马替尼和 LMB 联合可有效诱导伊马替尼耐药 Ba/F3 细胞的细胞死亡，显示 Bcr-Abl克隆进化的扩增或迹象。我们之前使用体外和体内模型的研究还表明，LMB 与阿霉素/顺铂/表没食子儿茶素-3-没食子酸酯的联合治疗可以协同增加肺癌细胞的化疗效果。LMB 在 NSCLC 细胞系（A549、H522 和 H358）而非正常人肺上皮细胞（BEAS-2B）中导致显着细胞生长抑制的能力进一步证明了其在肺癌治疗中的潜力。相比之下，Wang等人的研究显示新开发的 CRM1 抑制剂 (KPT-185) 和 EGFR TKI 对 NSCLC 细胞没有协同细胞毒作用。在我们的研究中，在 A549 和 H460 细胞中观察到的 KPT-330 和吉非替尼之间也没有协同作用（数据未显示）。

　　为了探讨吉非替尼（Gefitinib）与LMB在A549中的协同作用，我们检测了EGFR、p-EGFR、Erk1/2、p-Erk1/2、Akt和p-Akt等一系列蛋白在EGFR中的表达情况。通过比较单独的吉非替尼治疗和吉非替尼+LMB 联合治疗之间的差异来研究通路。之前的一项研究表明LMB对CRM1的抑制通过Erk1/2的过度磷酸化和p21的诱导介导了细胞凋亡，但在黑色素瘤细胞系中下调了抗凋亡存活蛋白。这可以解释我们研究中的观察结果，即与吉非替尼治疗的 A549 相比，吉非替尼 + LMB 共同治疗的 A549 中 p-Erk1/2 和 p-Akt 的表达更高而存活蛋白的表达更低。因此，LMB 和吉非替尼的协同细胞毒作用可能是由于它们在调节 Ras-Raf-MEK-Erk 和 PI3K-Akt 通路（EGFR 的两个主要下游信号通路）方面的相互作用。

　　我们的研究结果表明，LMB 在浓度为 0.5 nM 的 A549 中不仅可以克服原发耐药，还可以延迟吉非替尼（Gefitinib）的获得性耐药。除了上述途径的相互作用外，LMB 和吉非替尼的协同作用可能取决于 LMB 的浓度。为本研究选择的 0.5 nM LMB 剂量显示出测试的不同 LMB 剂量的最大协同效应（数据未显示），并且对 A549（对照的 89±4%）或 H460（对照的 92±5%）具有非常低的细胞毒性作用。事实上，在我们之前的研究中，0.5 nM LMB 已与阿霉素或顺铂联合使用。在 A549GLR（对照的 88±5%）中未观察到 0.5 nM LMB 的获得性抗性，而 A549GR（对照的 96±3%）对 0.5 nM LMB 的抗性高于 A549GLR 和 A549（p<0.05）。此外，A549GR和A549GLR对阿法替尼的交叉耐药性表明，阿法替尼在A549GLR中的IC50（8.0±1.5 μM）远低于A549GR（20.0±2.7 μM），表明吉非替尼+LMB联合治疗肺癌细胞将继续受益于使用不可逆 EGFR TKI（如阿法替尼）的后续治疗。由于体外和体内肿瘤环境不同，进一步的体内实验可以验证LMB在降低吉非替尼获得性肺癌治疗耐药性方面的有效性。

　　综上所述，本研究发现LMB与吉非替尼联合治疗通过调节EGFR通路和细胞周期分布，显着提高了吉非替尼（Gefitinib）在A549中的疗效。LMB 与吉非替尼联合治疗可以通过逆转 EMT 和下调 Akt-survivin 激活来有效延缓 A549 获得性耐药的发展。我们的研究表明，上皮标志物 E-钙粘蛋白和间充质标志物波形蛋白的表达可能是 EMT 中的两个独立事件。未来的体内研究、CRM1 抑制剂与 EGFR TKIs 的不同组合以及最终的临床试验都是必要的，以验证 CRM1 抑制作为一种新的治疗策略的潜力，以克服 EGFR TKIs 在 NSCLC 治疗中的原发性和获得性耐药性。微信扫描下方二维码了解更多：