在黑色素瘤中，MAPK 通路中最常见的突变成分是BRAF基因；其中，最普遍的BRAF突变（近 90% 的病例）表现为在 600 位用谷氨酸取代缬氨酸 (V600E) 。这种氨基酸变化导致 BRAF 的致癌激活，其激酶活性增加，随后诱导下游 ERK 蛋白的磷酸化。组成性激活的 ERK 然后刺激细胞增殖和存活，维持肿瘤的维持和生长 。剩余的BRAF突变主要以其他 V600 亚型（V600K、V600D 和 V600R）为代表，约占致病基因序列变异的 8%。根据我们的经验，BRAF基因突变发生在 43% 的原发性黑色素瘤和 48% 的转移性黑色素瘤中 。
最近使用两种选择性抑制剂在黑色素瘤治疗中取得了显着的好处：vemurafenib (PLX4032)，它似乎特别作用于 BRAFV600E突变体（尽管它已被证明也能抑制表达其他密码子 600 BRAF 突变的黑色素瘤细胞系的增殖： V600D，V600K，和V600R），和达拉非尼（dabrafenib）（GSK2118436），其已被证实主要抑制BRAF激酶活性V600E / K的突变体。
为了研究后一种化合物是否可以对更广泛的 BRAF 突变体（类似于先前报道的 vemurafenib/PLX4720 ）发挥抑制作用，黑色素瘤细胞系携带两个最常见的BRAF突变（V600D 和 V600R）在这里用达拉非尼治疗，然后评估细胞增殖。
为了确定对增殖的影响，黑色素瘤细胞系用递增浓度（3 至 100 nM）的达拉非尼处理 72 小时，一式三份。为了评估对 ERK 激活的抑制作用的发生，在用 BRAF 抑制剂处理 72 小时后对从细胞系中提取的总蛋白质进行了蛋白质印迹分析。特别是，磷酸化 ERK 的速率是根据细胞裂解物的等量总蛋白估算的；GAPDH 用作总蛋白表达水平的内部对照。使用 Burker 细胞计数，在 7 天内每 24 小时重复测量一次细胞数，确定细胞倍增时间。
结果：
使用一组源自切除的原发性和转移性肿瘤的黑色素瘤细胞系，我们研究了达拉非尼（dabrafenib）对培养的黑色素瘤细胞发挥抗增殖活性和阻断突变 BRAF 诱导的 ERK 信号传导的能力。在我们的分析中，LCP 黑色素瘤细胞系携带 BRAFV600R突变，而 WM266 黑色素瘤细胞系呈现 BRAFV600D变异;具有野生型BRAF的 M257 黑色素瘤细胞系用作对照。
在我们的系列中，dabrafenib 在携带突变BRAF 的两种黑色素瘤细胞系（无论突变类型，BRAFV600D或 BRAFV600R）中均显示出显着的细胞增殖抑制作用，而在呈现野生型的对照细胞中缺乏显着的抗增殖作用BRAF。关于对 ERK 信号的干扰，与具有野生型BRAF 的对照细胞相比，具有 BRAFV600D/R突变的细胞系对磷酸化 ERK 的抑制更快更强。
据报道，达拉非尼（dabrafenib）对 BRAFV600E/K突变体具有特异性活性；这里提供的数据强烈表明 BRAFV600D/R突变也可能被包括作为药物的有效靶点。然而，尽管 BRAFV600D/R突变构成了整个BRAF基因致癌变异组的一小部分，但从实用的角度来看，对更广泛的 BRAF 突变靶点显示有效性的药物的可用性可能会有所帮助，允许临床医生扩大可能受益于更有效的靶向治疗的黑色素瘤患者的子集。
结论：
尽管在一系列有限的黑色素瘤细胞系上进行，我们的研究提供了证据表明达拉非尼（dabrafenib）可能对BRAF 的致癌变异发挥更广泛的抑制活性。微信扫描下方二维码了解更多：
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