克唑替尼(crizotinib)和达沙替尼组合治疗胶质母细胞瘤

　　多形胶质母细胞瘤（GBM）是最常见和侵略性的原发性脑肿瘤。尽管手术，放疗和化学疗法取得了进步，但患者的平均生存期仅为14.6个月。在大多数GBM肿瘤中，酪氨酸激酶显示出增加的活性和/或表达，并积极促进治疗耐药性的发生，复发和发作。使抑制成为一种有吸引力的治疗策略。我们比较了12种酪氨酸激酶抑制剂的体外细胞毒性。克唑替尼（crizotinib）和达沙替尼（dasatinib）的组合在已建立的和原始的人GBM细胞系中表现出最大的细胞毒性。联合治疗诱导凋亡细胞死亡和多倍体。此外，联合治疗导致几种酪氨酸激酶受体（如Met和EGFR）和下游效应子（如SRC）的表达和定位发生改变。此外，组合治疗减少了GBM细胞的迁移和侵袭并防止了体外内皮细胞管的形成。总体而言，我们的研究证明了克唑替尼和达沙替尼的组合在多种GBM细胞系中具有广泛的特异性。这些发现为深入了解GBM替代疗法的发展提供了见识。

　　本研究描述了四个已建立的和两个主要的GBM细胞系对TKI，克唑替尼和达沙替尼的组合的反应。达沙替尼抑制多种在GBM中过表达或组成性活跃的酪氨酸激酶，例如SRC家族激酶，Kit，巨噬细胞集落刺激因子受体，PDGFR-α和-β，EphB1，EpHB2和EphB4。在我们的研究中评估了广泛选择的TKI的交叉检查确定SRC为目标蛋白。SRC在多种细胞表面受体（例如Met，PDGFR，EGFR和EGFRvIII）的信号转导中起关键作用，在25％至64％的GBM患者中表达。SRC参与多种细胞过程的调节，包括细胞体积调节，细胞增殖和侵袭。在本研究中考虑的细胞系中，SRC具有组成性活性，在患者肿瘤样品中也观察到了。组合治疗中使用的另一种TKI克唑替尼可抑制多种酪氨酸激酶，包括Met，RON和ALK。在这项研究中，由于对ALK和ROS1对GBM的贡献缺乏了解，我们仅考虑了治疗对Met表达的影响。Western印迹证实，单一处理和联合处理均抑制了SRC和Met的信号传导，而联合处理在已建立和原代细胞系中均有效抑制了增殖和下游下游效应子AKT的活性。此外，组合处理足以减少已知酪氨酸激酶的表达中过表达，并促进如EGFR和FAK GBM的进展和侵袭。

　　达沙替尼在临床试验中已被证明具有良好的耐受性，但单药治疗或与厄洛替尼，洛莫司汀或贝伐单抗联合用于复发性GBM均不能改善总体生存率。达沙替尼疗效有限的原因是由于在血脑屏障（BBB）上高表达的ATP结合盒转运蛋白（如P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌抗性蛋白）的活动导致大脑中的蓄积不良和成胶质细胞瘤细胞。我们的数据和以前的研究数据表明有限的功效也可能是达沙替尼具有细胞抑制作用而不是细胞毒性作用的结果。达沙替尼治疗48和72小时后，治疗后不存在凋亡和坏死标志物以及G1期增加，突显了这种效果。

　　迄今为止，尚未完成检查克唑替尼对GBM患者的疗效的临床试验。虽然，已经出现了发起的Met测试抑制剂几个临床试验中使用的小分子抑制剂。克唑替尼的BBB渗透性较差；然而，血脑屏障通常在肿瘤病变区域被严重破坏，并且肿瘤脉管系统的病理变化增加了对小分子的通透性。克唑替尼也是P-gp转运的有效抑制剂，克唑替尼治疗有可能通过减少它们从肿瘤组织的流出而延长与达沙替尼的组合的疗效。可能地，联合治疗足以促进凋亡细胞死亡，在去除药物后维持长达72小时。这是一个令人鼓舞的观察，因为它降低了由于细胞进入细胞死亡而产生抗药性的可能性。

　　已证明达沙替尼和克唑替尼的组合可增加细胞凋亡，但也可显着降低GBM细胞的增殖。通过蛋白质印迹，FACS和免疫细胞化学分析证实了通过联合处理促进了细胞周期在G2/ M期中的细胞周期停滞和多倍体细胞的形成。细胞周期的扰动与所有细胞系中CD1表达的减少有关。CD1表达通常与从G中的过渡相关联的1/ S和S / G2，然而，在癌细胞，其表达在整个S和G高2/ M期，促进了视网膜细胞瘤蛋白的组成型磷酸化。CD1表达受SRC调控和SRC活性的下调足以降低CD1的表达，进而降低细胞的增殖。然而，在克唑替尼处理的细胞中观察到CD1上调，并与多倍体细胞比例增加有关，也可在克唑替尼治疗后观察到。

　　G2/ M期的细胞周期停滞通常足以触发细胞凋亡。在我们的研究中，联合治疗中观察到的G2/ M期细胞比例的增加与凋亡细胞的数量有关。G2 / M期累积可能是克唑替尼和联合治疗后观察到的异常有丝分裂纺锤体形成的结果，通常与染色体分离受损，G2/ M阻滞和凋亡增加有关。

　　我们还观察到克唑替尼治疗后多倍体（4X和8X DNA）细胞数量增加，这似乎与凋亡细胞数量减少有关。研究表明多倍体与细胞凋亡抗性有关。尽管联合治疗相对于对照也增加了多倍体细胞的比例，但相对于克唑替尼治疗，多倍体细胞的比例却降低了。这种组合可避免克唑替尼单药治疗引起的遗传不稳定性，从而降低治疗抵抗力。

　　此外，我们的结果表明，联合治疗可减少迁移和减少细胞侵袭，这对于转移都是必不可少的。达沙替尼和克唑替尼组合的抗侵入潜力在克唑替尼浓度低时发生。由于侵入周围健康的大脑最终会降低GBM的所有标准治疗方法的疗效，因此这一效果尤其重要。传统的化学疗法通常对入侵细胞无效，因为这些细胞抑制了它们的增殖，减少了由促进DNA损伤的物质引起的损伤。此外，GBM病变高度血管化，但是抗血管生成疗法在GBM中显示出较差的疗效。我们的结果表明，在体外模型中，达沙替尼和克唑替尼的组合可减少血管生成和血管拟态。抗血管生成和抗侵袭特性的组合是必不可少的考虑因素，因为抗血管生成疗法贝伐单抗的临床实用性受到侵袭表型的促进。

　　总之，我们的结果表明，达沙替尼和克唑替尼的组合足以促进细胞凋亡，减少细胞迁移和侵袭并消除新血管生成。这种组合足以减少GBM生存和治疗耐药性所必需的信号传导途径的活性。这些发现表明该组合方法具有治疗潜力，并且有必要进行进一步的研究以测试其体内功效。微信扫描下方二维码了解更多：