克唑替尼(crizonitib)的活性不仅依赖于ALK和MET抑制

　　横纹肌肉瘤（RMS）是儿童和青少年中常见的恶性软组织肿瘤。间变性淋巴瘤激酶（ALK）和MET基因的异常表达已牵涉RMS的恶性进展，尤其是在肺泡亚型中。该观察结果表明，尽管尚未研究克唑替尼（crizonitib）（一种针对ALK和MET的激酶抑制剂）对RMS的治疗作用，但其在这种恶性肿瘤中的抗肿瘤活性尚未得到研究。

　　方法

　　RH4和RH30肺泡RMS（ARMS）细胞系用克唑替尼处理，然后通过增殖，生存力，迁移和集落形成分析进行评估。为了研究与克唑替尼活性有关的可能分子机制，使用了多种方法，包括流式细胞术，免疫荧光，蛋白质印迹和基于siRNA的敲除。

　　结果

　　体外用克唑替尼治疗可抑制ALK和MET蛋白，以及胰岛素样生长因子1受体（IGF1R），并伴随AKT和ERK的强烈脱磷酸作用，这两种下游激酶均参与RMS细胞增殖和存活。暴露于克唑替尼会损害细胞生长，并且在G2 / M期的积累归因于检查点调节剂（如细胞周期蛋白B1和Cdc2）的表达和激活改变。克唑替尼能够以剂量依赖性方式诱导凋亡和自噬，如caspase-3激活/ PARP蛋白水解切割下调和LC3激活/ p62下调所示。活性氧（ROS）的积累似乎对crizotinib在RH4和RH30细胞中的作用有所贡献。而且，

　　结论：这些结果提供了对克唑替尼在ARMS细胞中影响的分子机制的进一步了解，从而推断它可能是ARMS癌症治疗中的有用治疗工具。

　　最近的临床研究已经报道克唑替尼，ALK / MET活性的ATP竞争性抑制剂的有希望的治疗的影响，在ALK-和/或MET阳性肿瘤治疗。然而，在其RMS抗肿瘤特性，其中最常见的软组织肉瘤在儿童，直到最近才受到质疑。在ALK的表达和致癌活性日益增长的兴趣在RMS 暗示克唑替尼在该恶性肿瘤中可能的治疗作用。因此，本研究调查了crizonitib对RH4和RH30人ARMS细胞系的可能作用和分子机制，后者在mRNA和蛋白质水平上过表达ALK和MET基因。在临床相关浓度（≤5μM）下，克唑替尼处理的细胞显示出增殖和活力的显着降低。有趣的是，根据Peron等人最近发表的一篇文章，这两种肿瘤细胞系中细胞生长的减少主要与细胞周期停滞和凋亡/自噬有关。这项研究强调了克唑替尼暴露后，RH4和RH30细胞以G2 / M期积累，并表现出细胞分裂缺陷的形态学改变，例如核增大或多核。这归因于重要的细胞周期调节剂的放松管制。特别地，克唑替尼治疗导致细胞周期蛋白D3表达的下调和p21 / p27蛋白的过度表达。就此而言，据报道与CDK4相关的细胞周期蛋白D3活性对于紫外线照射后细胞周期从G2期进入有丝分裂是必需的。更具体地说，克唑替尼会导致Cdc25C蛋白的胞质保留和在Thr14 / Tyr15上伴随的Cdc2过度磷酸化，而细胞周期蛋白B1则过表达并主要聚集在核膜周围。综上所述，这些数据表明克唑替尼通过隔离细胞质中的Cdc25C从而激活Cdc2的磷酸化来激活ARMS细胞中的G2 / M检查点，而Cdc2不能与细胞周期蛋白B1形成活性复合物，从而阻止了Cdc2的进入。细胞核和为在其它癌症报道[失速有丝分裂。此外，细胞周期的扰动也可能与克唑替尼改变细胞微管动力学的能力有关，如多极纺锤体的形成所揭示的那样。

　　总体而言，我们的数据表明，克唑替尼依赖性G2 / M检查点的诱导显着促进了RH4和RH30细胞的生长，存活和克隆形成性的体外降低。即使最初将克唑替尼报告为ALK和MET抑制剂，该研究仍支持该药物可能通过影响其他在其某些结构域中显示结构类似物的RTK的活性来发挥作用的证据，因此在更大范围内下游分子靶标库。需要进行进一步的研究，以更好地了解这些额外的信号传导途径以及级联组分之间的相互作用，并监测体内克唑替尼对RMS生长的影响。RMS的当前治疗方法是外科手术，化学疗法和放射疗法的结合。然而，对化学疗法和放射疗法的抵抗力的发展通常是一个重要的限制因素，导致治疗失败和不良的生存。正如前面的研究表明，ALK和IGF1R途径的抑制可以增强肺癌化疗和放疗，克唑替尼可能是与侵袭性肿瘤ARMS过表达ALK，MET和IGF1R的蛋白质的有效额外的治疗剂。

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