帕纳替尼ponatinib对伊马替尼耐药的FIP1L1-PDGFRα突变体具有活性

　　在本研究中，帕纳替尼ponatinib有效抑制了WT和看门人突变体T674IFIP1L1-PDGFRα的磷酸化及其下游信号传导。我们的分子对接分析显示，在DFG-out（非活性）结合模式下，ponatinib可以靶向天然或T674IFIP1L1-PDGFRα，类似于Ponatinib在T315IBcr-Abl中的对接。ponatinib的这种特性可能与其咪唑并哒嗪核有关，该核占据酶中腺嘌呤的口袋，而甲基苯基基团占据酶的守门残基后面的疏水口袋。受到insilico的鼓励根据模拟结果，我们在体外和体内评估了普纳替尼对伊马替尼耐药CEL细胞的疗效。　　

　　Ponatinib有效抑制表达WTFIP1L1-PDGFRα的EOL-1细胞的活力，IC50值为0.004nM。这种功效与最近的结果一致，表明在EOL-1细胞中具有抑制作用，IC50为0.5nM。在同一研究中，ponatinib抑制表达Bcr-Abl、Flt3、KIT、FGFR1的恶性细胞，IC50值为2至36nM。我们发现ponatinib对伊马替尼耐药的白血病BaF3-T674IFIP1L1-PDGFRα细胞具有抑制作用，IC50为2.5nM，与BaF3-T315IBcr-Abl细胞中的效力相当，IC50为11纳米。克隆形成试验证实，ponatinib在低纳摩尔浓度下抑制BaF3-WT或-T674IFIP1L1-PDGFRα细胞的增殖。此外，我们的体内数据显示，口服剂量为30毫克/公斤/天的普纳替尼有效地抑制了异种移植伊马替尼耐药BaF3-T674IFIP1L1-PDGFRα细胞的生长，同时高度抑制了PDGFRα信号。一项小鼠药代动力学研究表明，以30mg/kg的单次口服剂量口服给予普纳替尼，耐受性良好，在给药后2小时和6小时的平均血浆浓度分别为782和561nM。对于所有3种表达FIP1L1-PDGFRα的细胞，这种血浆水平都大大超过了体外IC50值，因此普纳替尼可以以临床可达到的剂量有效抑制FIP1L1-PDGFRα阳性细胞的生长。　　

　　Ponatinib在伊马替尼敏感和抗性CEL细胞中均诱导显着的细胞凋亡，如膜联蛋白V结合、caspase-3的激活和PARP的特异性裂解所证明的那样。细胞凋亡是由线粒体依赖性途径触发的，因为用普纳替尼治疗后AIF和细胞色素c释放到细胞质中。在ponatinib介导的凋亡CEL细胞中，survivin、Bcl-XL和Mcl-1的水平降低。Survivin和Bcl-XL的转录受Stat3、Stat5和Erk1/2的调控。survivin和Bcl-XL表达降低由ponatinib治疗引起的可能与Stat3、Stat5和Erk1/2的抑制有关。然而，未来的实验可以进一步定义精确的机制。　　

　　Mcl-1是Bcl-2家族中一种半衰期相对较短的促存活和抗凋亡蛋白，在恶性血液细胞中表达，并保护细胞免受包括TKI在内的化疗药物的凋亡。Ponatinib在CEL细胞中降低Mcl-1可能促进细胞凋亡，因为用siRNA沉默Mcl-1显着增强了EOL-1细胞中Ponatinib介导的细胞凋亡，这与降低Mcl-1水平使白血病敏感的发现一致细胞酪氨酸激酶抑制剂。Mcl-1的强制过表达保护CEL细胞免受ponatinib响应的凋亡。关于ponatinib降低Mcl-1水平的机制，我们的结果不支持泛素蛋白体和转录依赖性途径的参与。相反，我们的数据支持caspase-3依赖性机制，这与其他小分子酪氨酸激酶抑制剂的发现一致。值得注意的是，被激活的caspase-3切割的Mcl-1128-350(p28)的截短形式可以增强细胞凋亡。Mcl-1128–350(p28)在ponatinib治疗后可能对细胞凋亡产生正反馈。尽管Bim已被报道为TKIs处理的CML细胞中的主要死亡效应物，但在本研究中，ponatinib处理的CEL细胞没有发现明显的变化。然而，由于Mcl-1已被证明通过复合物形成中和Bim以防止细胞凋亡，我们观察到的Ponatinib对Mcl-1的下降会增加Bim/Mcl-1的比率，这可能会释放Bim以促进细胞凋亡。　　

　　由于β-catenin在细胞增殖、分化和凋亡中的基本功能，观察到的由ponatinib暴露诱导的β-catenin减少可能很重要。除了在一个的Wnt/GSK3β相关的方式，β连环蛋白累积也可积累由酪氨酸激酶磷酸化后（例如，BCR-ABL，RET，KIT，FLT3，PDGFRα）。通过用普纳替尼处理EOL-1细胞灭活PDGFRα抑制酪氨酸磷酸化(Y654)并同时降低β-连环蛋白的水平，如免疫印迹和免疫荧光染色所反映的。沉默PDGFRα也降低了β-catenin水平，这进一步支持了PDGFRα对β-catenin水平影响的特异性。用普纳替尼预处理的EOL-1细胞的周转率提高。值得注意的是，帕纳替尼对PDGFRα的灭活降低了细胞溶质和核池中的β-连环蛋白水平。在体内实验中，Ponatinib还降低了异种移植物中的β-连环蛋白水平。　　

　　ponatinib降低β-catenin水平具有功能性后果。首先，在用普纳替尼处理的EOL-1细胞中，TCF/LEF依赖性基因转录受损。其次，β-连环蛋白依赖性基因如c-Myc和细胞周期蛋白D1的表达降低。第三，正如EMSA所揭示的那样，β-连环蛋白和DNA的结合也降低了。由于β-连环蛋白在控制正常和癌症干细胞的自我更新和分化中起着至关重要的作用，因此β-连环蛋白水平的降低可能是普纳替尼抗肿瘤机制的一个重要方面。未来研究的一个有趣假设是减少的β-连环蛋白是否可以促进癌症干细胞的根除。　　

　　据报道，ponatinib对伊马替尼耐药的FIP1L1-PDGFRα突变体具有活性。我们的结果通过提供诱导细胞凋亡的机制和体内功效的证据，证实并扩展了他们的发现。详情请扫码咨询：