卡博替尼Cabometyx通过在MET中的试验治疗详情

　　对于该实验，直到肿瘤大小达到300至400 mm3时才开始治疗，并且每天一次给予卡博替尼（Cabometyx）（30 mg / kg）或赋形剂仅3天。在最后一次治疗后3小时处死小鼠（n＝ 3 /组），并且将肺和实体瘤在裂解缓冲液中匀浆以进行Western印迹分析。将溶于300μLPBS中的SK-HEP1细胞（1×106个细胞）直接注射到5至6周龄的雌性裸鼠的尾静脉中。注射后立即随机分组（n= 6 /组），并用卡博替尼（30 mg / kg），索拉非尼（30 mg / kg）或ddH2O口服治疗。每天治疗28天后处死小鼠，并称重他们的肝脏和肺脏，并取样以进行组织切片。为了检查转移，从每只小鼠的肺和肝切下100个连续切片（5μm），每10个切片用苏木精和曙红（H＆E）染色。通过免疫组织化学（IHC）确定每组中磷酸化MET（p-MET）的表达。

　　从2008年1月至2012年12月在中山大学中山纪念医院（中国广州）接受肝切除术的可能治愈性治疗的29例患者中获得档案HCC标本。这些患者在病理上被诊断为具有微血管的HCC入侵。由于微血管浸润是与切除后HCC复发相关的最有力因素之一，因此患者同意接受索拉非尼作为辅助疗法。SK-HEP1和HepG2细胞获自美国典型培养物保藏中心。MHCC97L和MHCC97H细胞由中国科学院细胞库提供。这些细胞系维持在补充有10％FBS（GIBCO BRL），100 U / mL青霉素和100 U / mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM; GIBCO BRL）中。HUVEC（人脐静脉内皮细胞）购自ScienCell Research Laboratories，并根据制造商的说明保存在EBM-2培养基中。2013年，北京微读基因技术有限公司使用短串联重复序列DNA测试对这4种HCC细胞株进行了认证。作者未对HUVEC进行认证。将所有细胞培养物保持在37°C的CO2中孵化器，其受控湿度为95％的空气和5％的CO2。

　　本研究中使用的试剂和抗体在补充材料和方法中进行了描述。细胞活力，集落形成，细胞周期和凋亡分析如补充材料和方法中所述进行细胞活力，集落形成，细胞周期和凋亡分析。蛋白质印迹分析用含有蛋白酶抑制剂（Complete； Roche）和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解来自溶媒对照和卡博替尼治疗的小鼠的细胞或分离的独立组织。使用双辛可宁酸测定法测定蛋白质浓度，并在上样前进行平衡。通过SDS-PAGE分离出总共25至50μg的蛋白质，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。封闭膜并用相关抗体印迹。用增强的化学发光试剂检测到辣根过氧化物酶偶联的二抗。GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）用作上样对照。除GAPDH抗体外，所有抗体稀释度均为1：1,000，

　　体外迁移和侵袭试验伤口愈合和Transwell分析用于检查HCC细胞的迁移。如补充材料和方法中所述确定细胞的侵袭性。将5至6周龄的雌性BALB / c无胸腺裸鼠（中国中山大学实验动物中心）用于体内研究。给所有动物随意喂食标准饮食，并以12/12小时的明暗循环饲养在温度受控的动物设施中。所有程序均按照《 NIH实验动物的护理和使用指南》进行，并得到中山大学生物伦理学委员会的批准。

　　MHCC97H和HepG2异种移植模型是通过将肿瘤细胞（5×107/mL）与Matrix一起以1：1的比例皮下注射到PBS中而建立的。将细胞悬浮液以0.2mL的总体积注射到小鼠的右胁腹中，并使其生长2周以达到约80至200mm3的肿瘤大小。然后将小鼠随机分为三组（n= 8 /组）：溶媒对照（ddH2O，口服），卡博替尼（10 mg/kg/d，口服）或卡博替尼（30 mg / kg / d，口服）连续14天。从治疗的第一天开始，每两天测量一次肿瘤尺寸和体重。其中l和w表示每次测量收集的较大和较小尺寸。治疗14天后将小鼠处死。切除实体瘤，称重，然后进行石蜡包埋或速冻处理，并保存在-80°C下。体内抑制VEGFR2，MET及其下游途径的表达

　　准备好冷冻的5μm厚的肿瘤样品切片，用抗CD31（1：100）抗体测定血管密度。为了评估增殖和凋亡，分别用抗-Ki-67（1:50）和抗切割的PARP（1:50）抗体对5μm石蜡包埋的切片进行染色。阻断内源性过氧化物酶活性后，将切片与一抗在4°C孵育过夜。根据制造商的说明，使用Polink-2 Plus IHC检测系统（北京中山生物技术有限公司）完成检测。通过添加二氨基联苯胺（DAB试剂盒；北京中山生物技术有限公司）可视化切片。通过省略第一抗体获得阴性对照。

　　两名独立观察员对染色进行了评估。为了量化CD31染色切片中的平均血管密度（MVD），通过Image-Pro Plus软件（Media Cybernetics，Inc.）捕获每个肿瘤样品在×200放大倍率下的10个随机视野，并将其量化为CD31阳性面积/总面积。对于Ki-67和裂解的PARP，只有核免疫反应性被认为是阳性的。增殖指数和凋亡指数对应于每个区域至少500个细胞中标记的Ki-67或裂解的PARP细胞的数目，并以百分比表示。使用Studentt检验和具有Bonferroni校正的双向ANOVA对均值±SD值进行统计分析。得出统计学显着性，P＜0.05。现在卡博替尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。