鲁索替尼(ruxolitinib)抑制DCLK1的结构基础

　　鉴于双皮质素样激酶1 (DCLK1)在肿瘤生长、侵袭、转移、细胞运动和肿瘤干性方面的功能属性，它正在成为胃肠道肿瘤的治疗靶点。尽管针对DCLK1发现了一系列特异性或非特异性atp竞争抑制剂，但可以用于开发高选择性抑制剂或对化合物结合特异性的结构理解的不同类型支架仍然有限。在这里，我们提出了我们的工作，重新利用Janus激酶1抑制剂鲁索替尼（ruxolitinib）作为DCLK1抑制剂，显示出微摩尔结合亲和力和抑制活性。此外，为了深入了解其与DCLK1的相互作用模式，我们测定并分析了ruxolitinib复合物DCLK1的晶体结构。Ruxolitinib作为一种非特异性DCLK1抑制剂，有望为结构导向的选择性DCLK1抑制剂的发现提供一个起点。

　　尽管DCLK1已经成为胰腺癌、肠癌和结直肠癌的癌症干细胞标志物候选，但目前关于DCLK1激酶结构域的各种类型支架的假定抑制剂的结构知识仍然有限。在这方面，我们通过DSF方法从2104种临床应用的化合物中鉴定了几种结合和稳定DCLK1激酶结构域的支架，并通过SPR和HTRF方法验证了选定化合物的结合亲和性和抑制活性。然后，我们报道了DCLK1激酶结构域的复杂结构和最有效的抑制剂鲁索替尼（ruxolitinib），该抑制剂最初是作为Janus激酶(JAK1和JAK2)抑制剂开发的，用于治疗骨髓纤维化。在DCLK1激酶结构域中，鲁索替尼（ruxolitinib）作为atp竞争抑制剂发挥作用，在与激酶的C-lobe相互作用中，通过其丙腈基团，鲁索替尼（ruxolitinib）在JAK2中比在c-Src中采用类似的结合模式。此外，鲁索替尼（ruxolitinib）和其他DCLK1抑制剂的结构比较提供了一种新的针对DCLK1激酶结构域的支架，可以进一步利用它来设计更有选择性的抑制剂。

　　我们从数千种临床化合物中鉴定了鲁索替尼（ruxolitinib）靶向DCLK1的激酶活性。在新的治疗机会中，药物再利用是一种很有吸引力的药物发现方法，它可以最大限度地降低新药开发带来的风险和成本，并偶尔利用原药物的非预期效应，即所谓的脱靶效应。特别是，在癌症化疗中，激酶抑制剂占据了大多数基于脱靶的药物再利用案例，因为激酶抑制剂往往是非选择性的，许多激酶的失调参与驱动癌症。例如,酪氨酸激酶抑制剂crizotinib最初设计用于抑制参与肿瘤增殖和转移的c-MET，但也通过靶向棘皮微管相关蛋白4 (EML4)融合间变性淋巴瘤激酶(ALK)作为治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的抗癌药物。尽管存在血小板减少、贫血和中性粒细胞减少等副作用，鲁索替尼（ruxolitinib）仍被广泛认为是通过抑制失调的janus激酶(JAK1和JAK2)来治疗骨髓增殖性肿瘤(MPNs)。然而，ruxolitinib在1 μM浓度下也表现出了脱靶效应，抑制各种激酶，其中ROCK的抑制被认为会损害树突状细胞的迁移[33,34]。在这方面，我们的结果增加了鲁索替尼（ruxolitinib）对DCLK1激酶活性的新的脱靶抑制作用，并通过复杂结构证明了其ATP竞争抑制作用。此外，ruxolitinib在DCLK1激酶结构域的结合模式与ruxolitinib的原始靶蛋白JAK2几乎相同，验证了鲁索替尼（ruxolitinib）对DCLK1的脱靶抑制作用。血小板减少被认为是鲁索替尼（ruxolitinib）的一种不良反应，但也有争议，因为在巨核细胞分化末期血小板生成中，JAK2的负调控作用被认为是[35]。考虑到ruxolitinib对其他激酶如DCLK1的可能作用，这种新型脱靶效应的发现和进一步的研究可能使鲁索替尼（ruxolitinib）的脱靶药物重新应用成为可能。

　　然而，鲁索替尼（ruxolitinib）对DCLK1的结合亲和力(KD = 19.2μM)和抑制活性(IC50 = 1.6μM)似乎太弱，无法通过特异性靶向DCLK1激酶结构域引发显性生物学反应。在激酶中，鲁索替尼（ruxolitinib）与JAK2、c-Src和DCLK1的结合模式已被阐明。JAK2作为一种原始靶蛋白，对ruxolitinib表现出强烈的抑制活性，IC50值为2.8 nM(在1 mM ATP下)，而c-Src和DCLK1激酶的IC50值为微摩尔。鉴于一个激酶抑制剂ATP-competitive模式高度影响看门人残留，我们提出了一个更类似的亲和力ruxolitinib反对JAK2和DCLK1包含守恒的蛋氨酸残渣作为看门人对c - src比苏氨酸残基。尽管参与与ruxolitinib相互作用的DCLK1和JAK2激酶的残基几乎相同，但在体外实验(KD = 804 nM，微尺度热电泳)中测定了鲁索替尼（ruxolitinib）对JAK2的结合亲和力约强25倍。为了开发具有更高亲和力的DCLK1有效抑制剂，需要检测决定DCLK1和JAK2之间ruxolitinib结合亲和力差异的因素。虽然在晶体结构中没有捕捉到它，但我们的分子动力学模拟显示，ruxolitinib与JAK26VGL·ruxolitinib结构的铰链区域之间的接触略多于DCLK1KD·ruxolitinib结构(Supplementary Figure S5)，这可能是进一步设计DCLK1抑制剂的提示。然而，DCLK1和JAK2之间鲁索替尼（ruxolitinib）结合亲和力的25倍差异不能完全通过接触数量来解决。因此，这也意味着ruxolitinib需要变构调制来实现其特异性结合以及n -瓣和c -瓣之间形成的典型口袋，这需要进一步研究以开发有效的抑制剂。

　　DCLK1激酶结构域的选择性抑制剂,从相同的优化包含-benzodiazepin-6-one支架,这是利用目标各种激酶等非受体酪氨酸激酶2 (TNK2),富亮氨酸重复激酶2体内基因LRRK2()和细胞外signal-regulated激酶5 (ERK5)。为了提高DCLK1的选择性，这些抑制剂被附着在向c -叶突出的功能基团上，并与DCLK1激酶结构域的αD螺旋相互作用。此外，化合物DCLK1- In -1通过在-苯二氮杂卓-6-one支架[38]上添加三氟乙基，显示出对468个激酶中DCLK1和DCLK2的成功选择性，该支架与我们的对接模型中的gatekeeper Met465形成疏水接触。然而，苯并二氮杂卓-6- 1支架也可以抑制含溴结构域蛋白4 (BRD4)的溴结构域，由于BRD4在细胞周期调控、染色质组织和转录调控中的多效作用，阻碍了精确的治疗应用。由于ruxolitinib中显示的支架尚未发现与BRD4的溴结构域相关，它可能通过抑制BRD4而排除多性效应，从而成为DCLK1激酶结构域的替代候选。综上所述，通过将鲁索替尼（ruxolitinib）作为DCLK1抑制剂的新型支架与优化的与DCLK αD螺旋和gatekeeper Met465相互作用的功能基团结合，可以开发出选择性和强效的DCLK1抑制剂。这种可能导致DCLK1新类抑制剂的方法可以在今后的工作中进一步探索。微信扫描下方二维码了解更多：