他拉唑帕尼talazoparib在联合用药中的相对重要性

　　有报道描述了尤文氏肉瘤对PARP抑制的优先敏感性，这使人们对这类药物对尤文氏肉瘤有效产生了希望。然而，最初的临床转化尝试是不成功的，因为接受奥拉帕尼的尤因肉瘤患者没有观察到客观反应。此外，我们使用他拉唑帕尼的单药结果显示，尽管在低纳摩尔浓度下，尤文氏细胞系对他拉唑帕尼的体外敏感性，但单药在体内对异种尤文氏肉瘤没有活性。我们的研究结果为PARP抑制治疗尤文氏肉瘤的临床成功提供了另一种方法。引人注目的活动水平他拉唑帕尼+temozolomide协同作用的组合是一个显著的例子，两剂单独使用显示重大活动但结合使用一种低剂量的(≤20%的标准体内剂量)5天显示完整的反应，维持超过6周尤因异种移植。　　

　　在解释我们的组合测试结果时，一个关键点是组合的效果似乎与替莫唑胺作为单一药物发挥作用的机制无关。相反，这种活性可以解释为替莫唑胺引起的正常无毒病变的暴露。替莫唑胺单药细胞毒性是由于错配修复和胸腺嘧啶对o6-甲基鸟嘌呤(O6-meG)的去除和再插入的无效周期导致的，最终导致DNA复制的下一个周期诱导双链DNA断裂。　　

　　所有被检测的尤文氏细胞系和异种移植物已知都是MGMT表达体和/或在MGMT低表达细胞系有反应的浓度下对替莫唑胺表现出耐药性，排除了O6-meG病变是细胞毒性的主要贡献者。90%的替莫唑胺诱导的甲基加合物位于n7-鸟嘌呤或n3-腺嘌呤处，而正是这些病变似乎驱动了PARP抑制剂与替莫唑胺联合使用的细胞毒性。这些加合物通过BER途径修复，产生带有5'dRP端并与PARP结合的DNA单链断裂。在具有捕获PARP能力的PARP抑制剂(如他拉唑帕尼)的存在下，这些单链断裂成为细胞毒性病变。因此，他拉唑帕尼和替莫唑胺不应该被认为是一种增强替莫唑胺活性的组合。相反，它应该被认为是一种新的治疗策略，其细胞毒性可以由促进PARP捕获的非o6-meg甲基加合物启动。　

　　我们设计了我们的体内试验来评估替莫唑胺和他拉唑帕尼在联合用药中的相对重要性。如果替莫唑胺的作用机制是传统的，那么高剂量的替莫唑胺(30mg/kg/d)联合治疗方案应该比低剂量的治疗方案(12mg/kg/d)有效得多。　　

　　我们发现，使用极低剂量替莫唑胺与使用较高剂量替莫唑胺的联合治疗具有相当的活性，这支持了替莫唑胺的次要作用，并且与PARP抑制剂是联合治疗的细胞毒性成分的假设一致。使用低剂量替莫唑胺的策略对于临床转化是有吸引力的，因为低剂量的替莫唑胺减少了与替莫唑胺治疗相关的诱变负担。　　

　　他拉唑帕尼联合替莫唑胺治疗尤文氏肉瘤具有显著活性的发现具有潜在的临床意义，而另外一项发现，约有一半的尤文氏异种移植物对联合治疗反应有限，这提供了一个重要的警告，即耐药性机制将在治疗过程中重新存在或发展。未来研究的一个重要方向将是确定与联合用药敏感性和耐药性相关的因素。虽然我们无法确定预测反应的因素，但我们可以确定几个似乎与敏感性无关的因素，包括TP53突变(存在于一些敏感和一些耐药肿瘤中)和MGMT表达(存在于敏感和耐药肿瘤中)。　　

　　在非尤文族细胞系和异种移植物中，无论是在体内还是体外，MGMT低表达的细胞系似乎对他拉唑帕尼和替莫唑胺联合用药有反应。在体外，替莫唑胺作为单一药物需要多次细胞分裂才能产生细胞毒性，因此，当浓度低于300μM时，96小时观察到的效应仅是部分效应(由相对I/O%值>0%证明)。例如，GBM2对浓度低于300μM的替莫唑胺单药反应有限，而他拉唑帕尼使rIC50偏移85倍，相对I/O%接近−100%(表明96小时后细胞毒性反应完全)。在体内，5个低MGMT表达的异种移植细胞株中有4个对低剂量替莫唑胺和他拉唑帕尼均有完全反应，并维持至少6周。这表明，未被MGMT迅速去除的O6-meG加合物在他拉唑帕尼存在时可引发强大的细胞毒性反应。　　

　　在非尤文族异种移植物中，低剂量替莫唑胺加他拉唑帕尼的另一个反应是肾母细胞瘤异种移植物KT-10，它也对单药他拉唑帕尼有反应。最初的单剂试验使用每日x28时间表0.33mg/kg/天(给药周一至周五每日两次，周六至周日每日一次)，KT-10显示他拉唑帕尼在6周的MCR在这个剂量/时间表。KT-10在6周时，0.25mg/kg给药5天，也显示了CR反应。低剂量替莫唑胺联合他拉唑帕尼比单药他拉唑帕尼更有效，大多数接受单药治疗的动物在第84天出现再生，而接受联合治疗的动物没有一个出现再生。由于PALB2的双等位基因失活，KT-10的同源重组存在缺陷，提示低剂量替莫唑胺加他拉唑帕尼的治疗策略可能值得在同源重组修复缺陷患者群体中进行评估。　　

　　在单药或联合用药后进行药效学研究。KT-10和BT-45异种移植物均对单剂PARP抑制剂敏感。用他拉唑帕尼治疗5天后，在第5天给药后的4小时(KT-10)或24小时(两种肿瘤)，PARP水平均未检测到。在KT-10肿瘤中，γH2AX在给药4小时后显著增加，但在24小时后未检测到，而在BT-45异种移植瘤中，在两个时间点均检测到γH2AX。对于异种尤文氏肉瘤，单独使用替莫唑胺或他拉唑帕尼治疗的肿瘤在所有时间点都能检测到PARP，但只有在联合用药的反应性异种移植中PARP显著降低，而在联合耐药的异种移植中则没有。　　

　　通过对肿瘤裂解液进行热变性或DNA酶处理，试图恢复可能与DNA结合而无法在电泳过程中进入SDS-PAGE凝胶的PARP，但未能恢复该酶。因此，检测的降低可能不是PARP-DNA结合的结果。在对他拉唑帕尼单独或联合用药敏感的肿瘤中，使用人类特异性PCR检测的PARP转录量下降，而对联合用药敏感的肿瘤中，PARP转录量下降，这与联合用药第5天的PARP丢失一致。　　

　　目前尚不清楚PARP转录本和蛋白的丢失是否仅仅反映了肿瘤细胞通过凋亡而丢失，如GAPDH和γH2AX检测。PARP的损失记录符合模型EWS-FLI1监管的PARP转录取决于交互与PARP绑定PARP启动子，EWS-FLI1基因融合ESFTs取决于PARP1的活动，也是符合报告，ETS转录因子驱动PARP1表达ESFTs。然而，在我们的研究中，PARP缺失仅出现在尤文氏肉瘤模型中替莫唑胺治疗的背景下，或在对他拉唑帕尼作为单一药物有反应的肿瘤模型中。　

　　在体内，我们通过移植治疗后的第一个肿瘤重新生长，开发了对联合B有耐药性的TC-71异种移植物。在第二段中，肿瘤完全消退，但在2-4周后开始再生。随后的移植对治疗的反应逐渐减弱。

　　对增强DNA损伤/交互作用剂毒性的药物的一个担忧是，癌细胞和正常组织同样可以观察到这种增强作用。迄今为止使用增强剂的经验突出了这种风险，如使用MGMT抑制剂的经验(如o6-苄基鸟嘌呤和lomguatrib)。对于o6-苄基鸟嘌呤和洛美替溴，它们与烷基化剂(例如，亚硝基脲和替莫唑胺)一起使用，导致毒性增加，需要减少剂量，因此联合使用并不比单独使用单剂剂量的化疗药物更有效。　　

　　如上所述，这种担忧不适用于他拉唑帕尼与低剂量替莫唑胺的组合，因为该组合与单药替莫唑胺的作用机制不同。然而，他拉唑帕尼与拓扑异构酶I中毒的联合用药确实存在这种担忧。重topotecan活动水平的增强作用他拉唑帕尼我们观察到类似于报告其他拓扑异构酶毒物和PARP抑制剂。　　

　　在某种程度上，治疗的最佳预测窗口造成体外测试是深刻的敏感性的一个子集细胞系的设置相对电阻对于大多数细胞系(例如，高选择性和BRAF基因相关活动，筛选，拓扑替康对PPTP细胞系缺乏差异敏感性，这令人担忧。缺乏捕获PARP的能力对拓扑异构酶I中毒可能解释当他拉唑帕尼加拓扑替康的组合中观察到这种显著的变异时，他拉唑帕尼加替莫胺的活性差异的缺乏。　　

　　总之，他拉唑帕尼联合替莫唑胺对小儿临床前模型的几个亚组有显著效果，包括尤文氏肉瘤、低MGMT表达的模型以及对他拉唑帕尼单药反应的模型。与高剂量替莫唑胺方案相比，他拉唑帕尼在低剂量替莫唑胺方案中同样有效，这与他拉唑帕尼等PARP抑制剂捕获PARP的作用的新认识是一致的。将PPTP研究结果应用于临床，需要打破传统的增效药物与标准化疗药物结合的模式，这种模式优先考虑维持标准药物在或接近其常规剂量。　　

　　对于他拉唑帕尼，临床转化需要给予他拉唑帕尼一个有效的PARP诱闭剂量，然后滴定替莫唑胺到可耐受的程度，没有剂量限制的毒性。一项建立在该策略基础上的他拉唑帕尼(talazoparib)联合替莫唑胺治疗儿童和青少年难治性实体瘤的一期试验已经开始。详情请扫码咨询：