造血干细胞/祖细胞(HSPC)功能障碍和DNA损伤发生之间的因果关系已被提出。临床相关的策略来维持这些细胞的基因组完整性是需要的。本文报道了临床应用的促血小板生成素(TPO)受体小分子激动剂艾曲波帕促进人类热休克蛋白DNA双链断裂(DSB)修复。我们证明艾曲波帕特异性激活经典的非同源端连接(C-NHEJ)DNA修复机制，这是一种支持基因组完整性的途径。艾曲波帕介导的DNA修复可增强原代人类热休克蛋白的基因组稳定性、存活率和功能，这在核型分析、集落形成单位分析和免疫缺陷NSG小鼠移植后得到证实。艾曲波帕可能提供了一种新的治疗方式来保护人类热休克蛋白免受基因组损伤。
CD34+细胞从健康个体获得第一次培养24小时艾曲波帕的存在与否，暴露在低剂量(2gy)红外光谱、和转染DNA双边带修复记者plasmids24NHEJ或人力资源。艾曲波帕在IR后显著提高了NHEJ活性。由于DNADSBs只在细胞周期的S/G2晚期被HR修复，我们检测了HR在积极分裂CD34+细胞和表达c-mpl的HEL92.1.7细胞中的效率。在这些细胞中，艾曲波帕在IR后并没有促进HR活性。
为了区分快速操作的C-NHEJ修复机制和慢动力学的alt-NHEJ修复机制，将CD34+细胞按上述方法培养和照射，然后评估IR诱导的DSBs的指标H2AX磷酸化(γH2AX)在IR后不同时间的变化。在两种培养条件下，IR后1小时观察到H2AX磷酸化的最大百分比，表明艾曲波帕不能阻止hspc中DNADSB的形成。IR5小时后，大多数用艾曲波帕培养的细胞已溶解DNADSBs，而对照组中γH2AX+细胞的比例是对照组的2倍。观察到的效应是特异于艾曲波帕的；除去其他细胞因子并不能阻止DNA修复。在ir后24小时，对照组同样解决了DNADSBs，这表明在艾曲波帕缺失的情况下，DNA修复是通过一个缓慢作用的途径发生的。在培养基中添加TPO时也得到了类似的结果。
为了证实艾曲波帕通过促进一个具有快速动力学的途径来促进照射的人热休克蛋白DNADSBs修复，我们抑制了一种特异性于C-NHEJ途径的DNA-pk激酶。培养过程中添加DNA-pk抑制剂NU7441对1小时DNADSB形成和24小时DNA修复没有影响，但完全消除了用艾曲波帕在hpc中观察到的5小时DNADSB修复增强动力学。为了进一步证实这些发现，我们使用多光谱成像流式细胞仪在单个细胞分辨率下检测了核γH2AX聚焦。在ir后5小时，在艾曲波帕存在的情况下，每个HSPC检测到的γH2AX焦点频率也在培养过程中添加NU7441时显著增加。这些结果证实，艾曲波帕增强了人类热休克蛋白5小时内快速运转的DNA-pkk依赖性C-NHEJDNA修复机制。相比之下，在没有艾曲波帕的情况下，更多的细胞使用较慢的、DNA-pkk无关的、容易出错的alt-NHEJ机制在24小时内测定DNADSBs。
接下来，我们研究了促进C-NHEJ修复对辐照hspc基因组完整性、细胞生存和功能的影响。用艾曲波帕培养的经辐照处理的热休克蛋白细胞的中期显示染色体畸变明显少于未使用艾曲波帕培养的经辐照处理的热休克蛋白细胞，与未暴露于IR的热休克蛋白相比，其染色体畸变仅略微增加。与对照组相比，在培养过程中添加艾曲波帕也与受辐射hspc的凋亡显著减少(在5小时时测定)和存活率提高(在24小时时测定)有关。当用NU7441抑制C-NHEJDNA修复时，用艾曲波帕观察到的细胞存活益处被取消。
为了证实这些发现，我们鉴定了128个涉及DNA损伤信号、细胞周期调节、凋亡或DNA修复的基因，并通过RT-qPCR阵列比较了在添加或不添加艾曲波帕的照射下培养的热休克蛋白的表达。IR后5小时，与未加艾曲波帕培养的hpc相比，艾曲波帕（艾曲博帕）培养的细胞GADD45G、BBC3、PPM1D和CCNO四种促凋亡和生长抑制基因的表达显著降低(3-6倍)。为了评估这些发现的功能相关性，我们通过CFU祖细胞试验和NSG小鼠移植来评估细胞。在CFU检测中，用艾曲波帕培养的辐射hpcs产生的CFU比对照组多3-4倍。在异种移植试验中，在艾曲波帕存在下培养的ir暴露的热造血干细胞移植3个月后，与对照组相比，人细胞移植物增加了两倍。
总之，本研究建立在之前的研究成果的基础上，即TPO促进小鼠hpc的DNA修复，并将这一发现扩展到临床相关的c-MPL激动剂艾曲波帕，用于人类祖细胞和具有长期再生能力的细胞。由此得到的增强的基因组稳定性、细胞存活率和功能提示，艾曲波帕可能提供了一种新的治疗模式，用于预防癌症治疗中因IR引起的HSPC损伤，并可能对基因组不稳定综合征(如范可尼贫血)的治疗有意义。考虑到eltrobopag可能促进克隆进化的担忧，在前瞻性临床试验中密切监测是有必要的。详情请扫码咨询：
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