帕博西尼/哌柏西利刺激自噬小体形成的确切靶点目前尚不清楚

　　本研究是为了确定诱导自噬体形成的药物neratinib和帕博西尼是否相互作用杀死肿瘤细胞。我们的数据表明，这些药物以比相加方式更大的相互作用来杀死不同类型的肿瘤细胞。基于我们的积极数据，以及我们之前使用PDE5抑制剂和HDAC抑制剂都有助于更高水平的毒性自噬体水平的经验，我们随后确定，具有成本效益的HDAC抑制剂丙戊酸钠比PDE5抑制剂西地那非更能增强[neratinib+帕博西尼]的杀伤作用。在体内，neratinib、帕博西尼和丙戊酸钠相互作用可显著抑制肿瘤生长。　　

　　本实验室之前的研究表明，NSCLC药物培美曲塞与肝癌/肾癌中介药物索拉非尼相互作用，促进自噬小体形成水平升高，导致肿瘤细胞死亡。13个值得注意的是在ER+乳腺癌细胞系MCF7中的观察结果。众所周知，减少Beclin1函数在乳腺肿瘤发生中起着重要的作用，和MCF7细胞，单体型删除Beclin1。我们之前的研究表明，配对MCF7细胞抵抗了纯抗雌激素fulvestrant大大增加了Beclin1的基础表达水平，ATG5-ATG12，结果，显示出更大的自噬体形成，并对[培美曲塞+索拉非尼]组合比亲代MCF7细胞更敏感。　　

　　Neratinib批准作为ER-ERBB2+辅助治疗乳腺癌患者，和BT474细胞用于我们的研究从写明ATCC获得，原来生长在批量使用女性无胸腺的老鼠，但不需要任何额外的补充雌激素，因此这些tumorizedBT474细胞表达低水平雌激素受体和生长的体外和体内estrogen-independent时尚。也就是说，它们代表了从头开始的ERBB2+乳腺癌和已经从雌激素受体成瘾进化到需要ERBB2信号作为生存机制的ER+乳腺癌的模型；neratinib被批准用于的疾病亚型。我们之前发表了我们的肿瘤BT474细胞被neratinib作为单一药物通过一种需要表达Beclin1和ATG5.3的机制杀死。　

　　帕博西尼已被批准用于ER+ERBB2阴性乳腺癌的治疗，其用于患者的护理标准包括抗雌激素或抗芳香化酶治疗联合CDK4/6抑制剂。我们的数据表明，帕博西尼作为单一的杀伤药物也需要Beclin1和ATG5的表达，与neratinib联合使用也是如此。帕博西尼刺激自噬小体形成的确切靶点目前尚不清楚。其他人观察到帕博西尼和其他CDK4/6抑制剂可以诱导自噬。　　

　　有些人认为CyclinD1可以抑制AMPK激活，这可能与CDK4/6抑制剂与自噬有关。20CyclinD1的下调增强了AMPKαT172的磷酸化，而Cyclin的过表达阻止了代谢应激增加T172的水平；这与CyclinD1/CDK4/6磷酸化和失活LKB-1有关。不幸的是，这些作者用5倍大浓度的帕博西尼自己上面安全血浆C最大浓度，和我们的能力帕博西尼加强AMPKαT172磷酸化发生在非常低的细胞/不LKB-1表达式如HT1080(肉瘤)，A549和H460(NSCLC)和HCT116(结肠)。然而，其他人已经报道，帕博西尼CDK4/6-independent方式激活AMPK，这种效应可能是由于抑制CDK9等其他目标，也有类似的共识序列的CDK4/6ERK1/2，抑制CDK9与高架eIF2α磷酸化预测会严重减少的表达多个蛋白半衰期较短的如cyto-protectivemcl1的蛋白质，这反过来会促进线粒体功能障碍和Beclin1的释放。　　

　　我们发现帕博西尼不会导致mTOR失活，尽管它确实促进了适量的ULK-1S757去磷酸化。因此，帕博西尼可以降低mTOR的催化活性或修饰mTOR络合物的形成。帕博西尼激活AMPK，通过T172磷酸化水平的升高判断，这直接导致ULK-1S317、TSC2T1496和RaptorS792磷酸化水平的升高；AMPK的激活在药物联合致死中起着至关重要的作用。在先前使用neratinib的研究中，我们发现AMPKαT172磷酸化增强与ATM激活有关，然而帕博西尼并没有显著增强ATM活性。　　

　　超出本手稿范围的研究将需要确定帕博西尼是否改变了LKB-1和钙钙调蛋白依赖激酶的活性，也靶向AMPKαT172。总的来说，通过聚合和独立的信号通路，neratinib和帕博西尼相互作用促进自噬体的形成，这对肿瘤细胞的执行至关重要。在抗雌激素治疗中，乳腺癌细胞可以通过增加Beclin1表达和自噬而存活，单独使用帕博西尼或与neratinib联合使用可以与提高ERBB2表达和信号转导的机制平行，同时克服自噬抵抗机制。　　

　　一项联合neratinib和帕博西尼的I期临床试验已经在安德森癌症中心进行。该研究的剂量增加部分是找出neratinib联合依维莫司、帕博西尼或曲美替尼可给予晚期癌症患者的最高耐受剂量；特别是ERBB1、ERBB2、ERBB3或ERBB4特异性突变的肿瘤。这种方法是否在扩增的非突变ERBB2中也能成功尚不清楚。基于我们目前的发现，[neratinib+帕博西尼]联合治疗ERBB2+乳腺癌可能是一种新的有用的方法。我们将于2018年底在梅西癌症中心对所有实体肿瘤患者联合neratinib和HDAC抑制剂丙戊酸钠进行一期临床试验。　　

　　在其他临床前和临床研究中，我们使用PDE5抑制剂西地那非来提高激酶抑制剂的致命性。因此，基于我们对neratinib和帕博西尼相互作用的分子机制的初步研究，我们希望开发一种新的三种药物组合，进一步增强肿瘤细胞杀伤。我们确定丙戊酸或西地那非，这些也能增强自噬小体形成的药物，是否能提高[neratinib+帕博西尼]的疗效。　　

　　尽管丙戊酸盐和西地那非都比添加剂更能增强[neratinib+帕博西尼]的致命性，但在临床相关的使用浓度下，丙戊酸盐优于西地那非。丙戊酸加到[neratinib+帕博西尼]中，增强了自噬小体和自溶小体的形成，这种增强与肿瘤细胞杀伤水平相关。ATG5或Beclin1的敲低显著降低了[neratinib+帕博西尼]和[neratinib+帕博西尼+丙戊酸]诱导的肿瘤细胞死亡水平。　　

　　这也与一个强大的保护作用与减少细胞溶酶体蛋白酶组织蛋白酶b的表达在肿瘤细胞暴露于[neratinib+帕博西尼]，表达的半胱天冬酶8抑制剂c-FLIP-s适度降低肿瘤细胞死亡的水平而在细胞暴露在当天都表达c-FLIP-s或击倒FADD表现出很强的保护作用。三药联合治疗的细胞显示出死亡受体CD95的质膜水平升高，这表明受体激活。因此，在[neratinib+帕博西尼]中加入丙戊酸既增加了组织蛋白酶B激活的毒性自噬通量水平，同时也通过caspases8/10促进死亡受体激活，从而导致肿瘤细胞死亡。　　

　　任何药物或药物组合的安全性最初都是在一期试验中确定的。帕博西尼的限量毒性为中性粒细胞减少；neratinib的表现为结肠功能障碍/腹泻；丙戊酸钠肝毒性。因此，在我们的组合中，建议的三种药物没有一种与其他任何一种药物的主要限剂量毒性重叠。一旦[neratinib+帕博西尼]和[neratinib+丙酸酯]试验完成，具有各自确定的毒性，通过仔细安排，可能安全联合使用这三种药物。　　

　　丙戊酸盐可以提高其他药物的致命性的机制以前已经被我们的小组详细地探索过。丙戊酸盐可以通过抑制HDAC6来刺激内质网应激，而HDAC6会导致HSP90失活，进而导致异常折叠蛋白水平升高。值得注意的是，HSP90稳定了LKB-1，认为LKB-1不可能是我们的帕博西尼调节的激酶。eIF2α敲低降低了[neratinib+帕博西尼]和[neratinib+帕博西尼+丙戊酸]诱导的细胞杀伤(Booth和Dent，未发表的观察)。在其他诱导自噬的药物的存在下，如neratinib，这也会导致HDAC6和其他细胞HDACs的溶酶体依赖性降解，深刻改变细胞生物学。　　

　　在肿瘤中，这种生物学上的改变可以在药物治疗停止两周后观察到。例如，neratinib和丙戊酸钠通过下调HDAC的功能和表达，改变免疫原性生物标志物的蛋白表达。在本研究中，我们发现[neratinib+帕博西尼]也能迅速降低PD-L1、PD-L2、IDO-1的表达，并增加MHCA的水平。这些事件与免疫原性蛋白HMGB1的细胞外释放有关。[neratinib+帕博西尼]是否能被用作增强肿瘤细胞免疫原性和增强免疫检查点抑制抗体的作用的方法，还需要研究，超出了本文的范围。　　

　　本论文中的研究使用了廉价的非专利低疗效HDAC抑制剂丙戊酸钠。这是基于预先的认识，药物费用往往会使药物联合临床试验的表现成本抑制。我们对其他fda批准的HDAC抑制剂，包括vorinostat和etinostat，以及临床相关的HDAC抑制剂AR42进行了研究，证明这些药物也能增强[neratinib+帕博西尼]活性。希望在[neratinib+帕博西尼]和[neratinib+丙戊酸]试验完成后，能够启动[neratinib+帕博西尼（哌柏西利）+丙戊酸]联合的一项新的临床研究。详情请扫码咨询：