TAF稀释情况不同分别对上皮细胞的作用

　　如先前所述分离出间质成纤维细胞。简要地说，在除去上皮层后，收集含有基质成纤维细胞和免疫细胞的流通液，以500××g的速度离心10分钟，重悬，测定细胞数和生存力。新鲜分离的基质成纤维细胞和免疫细胞在T75细胞培养瓶（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）的完全培养基中孵育。每隔48小时更换一次培养基，以去除非贴壁细胞。细胞融合后，用胰蛋白酶处理，并以1××105细胞/孔的浓度接种到24孔培养板中，处理前至少48hr。从AIDS研究和参考获得粉末状的TFV。试剂计划（NIHID，美国国立卫生研究院艾滋病司，NIHAIDS试剂计划。 TFV的原液浓度为56mg/ml，方法是在5mgTFV粉末中加入16mlPBS，然后在剥离的培养基中稀释至合适的工作浓度。

　　TAF由吉利德科学公司（加利福尼亚州，福斯特城）提供，并以10μmM的浓度溶于PBS，无菌过滤，并使用260μnm处的消光系数为11690通过吸光度检查浓度。随后在完全培养基中将TFV和TAF稀释至适当的工作浓度。将TFV或TAF分别向顶极（管腔）和基底外侧区室的极化上皮细胞中添加24hr。对于某些实验，如结果所示，仅根尖添加TFV和TAF。处理后，将细胞洗涤，收获并在300μl的70％甲醇中溶解，并在如前所述进行TFV-DP评估之前立即保存在-80°C下。通过串联质谱液相色谱法测量细胞内TFV-DP浓度，并基于每个样品的细胞数将归一化值换算为fmol /百万个细胞32。腔和基底外侧隔室24小时，或仅根尖。本研究和我们先前的研究中使用的TFV-DP的测量时间基于初始临床试验，该试验在阴道中使用了局部TFV，并报告了针对女性HIV感染的有效保护措施在性交前24小时至性交后24小时之间服用。孵育后，将细胞在培养基中洗涤3次以去除细胞外TFV或TAF，然后将上皮细胞插入物转移到新孔中，并将新鲜培养基添加到顶端和基底外侧隔室中。 24小时后从细胞插入物的顶端和基底外侧室中回收条件培养基（CM）。

　　同样，将TFV或TAF加至在24孔板中生长至汇合的基质成纤维细胞中放置24小时，然后反复洗涤，然后添加新鲜培养基以在24小时时收集CM。对于上皮细胞时程实验，每隔24小时间隔更换每个隔室中的培养基，并在每个时间点收集CM。为了评估上皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用，将极化的上皮细胞插入物转移至含有汇合的对象配对成纤维细胞培养物的24孔板中。将TFV或TAF加入到极化的上皮细胞顶端24小时，然后收集基底外侧CM。在该培养结束时，将细胞插入物和培养室+/-成纤维细胞在顶端和基底外侧充分洗涤，以使上皮细胞和成纤维细胞均不含任何细胞外TFV或TAF。然后将细胞分为2组，分别由转移到新孔中的EC插入物（无成纤维细胞）和仅在下腔室的成纤维细胞组成。在每种组合中，添加缺少ARV的新鲜培养基，将细胞再孵育24小时，然后回收条件培养基并分析其抗HIV活性。

　　为了评估MRP在ARV运动中的作用，将上皮细胞与TFV或TAF孵育20分钟，然后添加人MRP特异性抑制剂MK571（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州）4小时。 将MK571加入250ul μl完全培养基中的顶端和基底外侧区室中，并在细胞漂洗和孵育后存在于新鲜培养基中。 24小时后，从细胞插入物的顶端和基底外侧室收集CM。 CM以10,000μg离心，并保存在-80°C下直到进行HIV感染检测。 未处理的对照细胞与供体匹配，并同时平行处理。 如前所述，使用CellTiter 96 AQueous One Solution细胞增殖试验（Promega，麦迪逊，威斯康星州，美国）和台盼蓝染色（HyClone Laboratories，Inc.，Logan，UT）处理后测试细胞活力。 所有样品均进行盲法测定，没有提供有关细胞来源和治疗的任何信息。那么taf哪能买到？价格是多少？需要购买可添加下方微信。