背景:
软骨肉瘤是一种恶性软骨性骨肿瘤,对放疗和化疗有抵抗作用。周期蛋白依赖性激酶4(CKD4)在人类癌症中高度表达,而CDK4的抑制剂帕博西尼已获FDA批准用于临床,用于癌症治疗。然而,CDK4的水平和治疗软骨肉瘤的可能性需要进一步的探索。因此,我们的目的是研究CDK4的水平和帕博西尼在软骨肉瘤中的治疗效果。
方法:
我们使用免疫组化分析来评估软骨肉瘤组织中人类CDK4的产生。采用MTT法、创面愈合法、transwell法和流式细胞术检测siRNA或帕博西尼对CDK4表达对软骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡和周期阻滞的抑制作用。westernblot和免疫荧光法检测CDK4/Rb信号通路。在体生物发光成像法测定了帕博西尼对骨内肿瘤生长的抑制作用。
结果:
在人类软骨肉瘤样本中发现CDK4显著表达。CDK4水平的升高与软骨肉瘤患者的恶性转移和不良预后相关。CDK4在人软骨肉瘤细胞系中也高表达,特异性siRNA和帕博西尼抑制CDK4导致细胞增殖减少,并伴有Rb磷酸化。此外,帕博西尼还通过CDK4/Rb信号通路诱导细胞周期阻滞在G1期,减少细胞迁移和侵袭。在软骨肉瘤体内给药可减轻肿瘤负担。
结论:
总之,这些数据强调了CDK4抑制剂,如帕博西尼,在人类软骨肉瘤的治疗中是有希望的。
在骨和软组织肉瘤中,如骨肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤和脊索瘤,CDK4的扩增与不良预后相关。在软骨肉瘤中,既往研究报道CDK4表达与患者标本和细胞系中的高级别软骨肉瘤相关,提示在软骨肉瘤的发病机制和治疗中发挥重要作用。与这些发现一致的是,在我们的研究中,CDK4在大多数检测的组织样本中都有表达。进一步研究软骨肉瘤的临床病理特征与CDK4表达的关系,提示CDK4表达与软骨肉瘤患者的临床治疗预后密切相关。
既往对横纹肌肉瘤的研究表明,CDK4对肉瘤细胞的生存和生长至关重要,其中CDK4的敲除可导致横纹肌肉瘤的增殖消失。在软骨肉瘤中,前期研究表明shrna介导的CDK4表达下调导致OUMS27、SW1353和CH2879细胞株的细胞活力和生长显著下降。与这些发现一致的是,我们还发现CDK4在所有研究的软骨肉瘤细胞系(CS-1和SW1353)中呈阳性染色,表明免疫荧光染色CDK4位于细胞核。通过使用siRNA特异性地敲除CDK4的表达,软骨肉瘤细胞的生长和Rb的磷酸化均被抑制。我们还注意到转染CDK4siRNA可以显著消除CS-1和SW1353细胞下游Rb分子的磷酸化水平。
针对CDK4的ATP结合位点,帕博西尼是首个临床批准的抗肿瘤CDK4抑制剂。最近,它被研究作为骨和软组织肉瘤的靶向治疗,如骨肉瘤,脊索瘤,滑膜肉瘤,因为它可以(前期)临床使用。在我们的研究中,在培养系统中添加帕博西尼可抑制细胞增殖,降低pRb的表达。由于帕博西尼治疗通常会抑制CDK4的活性,而不是表达水平,我们使用westernblot分析表明,帕博西尼没有影响CDK4的水平,而显著降低了pRb的表达。总的来说,我们发现CDK4表达的衰减可以以CDK4/Rb依赖的方式抑制软骨肉瘤细胞的增殖。
此前对CDK4的研究报道CDK4主要通过细胞周期进程中G1期向S期的增强过渡来发挥其功能作用。因此,我们通过细胞周期和细胞凋亡来探讨CDK4取消后软骨肉瘤细胞增殖抑制的可能调控机制。结果表明,CDK4消除后,软骨肉瘤细胞在G1期受到抑制,CDK4抑制可有效促进细胞凋亡。因此,帕博西尼治疗抑制CDK4可通过G1细胞周期阻滞增强细胞凋亡,从而减轻软骨肉瘤细胞的生存和增殖。帕博西尼可能是软骨肉瘤治疗的有希望的候选药物。
高达71%的高级别软骨肉瘤患者发生转移性病变,其10年总生存率低于29%。在TMA分析中,高水平的CDK4与较高的临床分期和较差的患者预后有关,提示CDK4在肿瘤转移中的必要性。由于细胞迁移和侵袭是癌细胞转移的关键步骤,我们观察到帕博西尼在软骨肉瘤中对CDK4/Rb信号通路的抑制作用。进一步,评估了帕博西尼介导的CDK4表达抑制对软骨肉瘤迁移和侵袭活性的影响。
令人惊讶的是,非致死浓度的帕博西尼可以抑制细胞的迁移和侵袭,这使我们推测这种疗效可能也在体内发挥作用。目前小鼠软骨肉瘤模型有多种,如皮下或原位模型。由于人类软骨肉瘤通常发生在骨头的髓质中,我们选择了一个在胫骨内注射肿瘤细胞的小鼠模型,这在最大程度上模拟了人类的病理。
基于直接在骨中注射荧光素酶转导的SW1353软骨肉瘤细胞的原位软骨肉瘤小鼠模型已经研制成功,该模型可通过生物发光成像来密切监测骨内肿瘤的生长。在该动物模型中,我们发现,与对照组相比,帕博西尼治疗小鼠的BLI强度较低,可以降低骨肿瘤负担。帕博西尼的这种抑制作用可能与抑制软骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移有关。此外,注射帕博西尼(哌柏西利)可显著减少恶病质,这进一步证明帕博西尼可能是软骨肉瘤治疗的有希望的候选药物。
我们的研究有一些局限性。对于基因组的改变,12q13的扩增和9q21的缺失是两个一致的遗传畸变。只有到/Rb通路测试在我们的研究中,其他本地化在这个地区,如负调节p53、鼠标双2分钟(MDM2)CDK6,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2(CDKN2A)编码的肿瘤抑制蛋白p16,没有检查,以及天然抑制剂到,p21和p27。
这是因为一些研究报道,这些突变只在主要为高级别中央软骨肉瘤的一个亚群中发现。在几乎所有高级别中央软骨肉瘤中,只有CDK4/Rb上调,可能具有最大的靶向治疗的潜力。也有许多新的精确治疗靶点,如可以增加肿瘤化疗敏感性的Bcl-2家族成员,以及生存蛋白激酶,如HIF1a、Src和PI3K通路。这些新的抑制剂需要进一步的研究。详情请扫码咨询:
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