为了研究帕博西尼的亚细胞定位，我们使用了具有RB1-和p53功能的人类黑色素瘤细胞系SK-Mel-103。在使用dna损伤药物(如博莱霉素或阿霉素、MDM2抑制剂nutlin或帕博西尼)治疗后，这些细胞有效地经历了衰老，这表明它们的细胞大小和SA-βgal活性基本上在所有培养细胞中都增加了。正如预期的那样，这伴随着phospho-RB1和FOXM1的缺失。FOXM1是一个成熟的CDK4/6磷酸化靶标，在缺乏CDK4/6活性的情况下高度不稳定。炎症因子的分泌进一步证实了衰老的诱导。值得注意的是，我们使用1μM帕博西尼，标准在许多细胞研究和不远的浓度范围实现等离子体的患者(0.2--0.4μM)。
我们观察到帕博西尼在405nm光激发下，在~500nm处发出强荧光信号，无论pH值为中性(7.5)还是酸性。在活细胞中，也可以使用同样的激发激光(405nm)检测帕博西尼荧光，并使用500-550nm滤光片收集发射光；在这些条件下，帕博西尼衰老细胞呈现出强烈的荧光信号，而博莱霉素、阿霉素或纳特林诱导的衰老细胞则不存在这种荧光信号。
帕博西尼衰老细胞产生的信号被FACS检测为一个比其他方法如阿霉素或博莱霉素诱导衰老细胞自身荧光特征所对应的峰值强度更高的峰值。在所有测试的帕博西尼反应细胞中都发现了这一结果，包括黑色素瘤细胞(SK-Mel-103)、肝癌细胞(HuH7)、肺癌细胞(H226)和正常人成纤维细胞(IMR90)。在显微镜下，帕博西尼荧光显示了一个斑点的核周定位，这让人想起溶酶体SA-βgal活性的定位。事实上，帕博西尼荧光与lysotracker荧光共定位，lysotracker是一种荧光染料，用于标记活细胞中的酸性细胞器。这些观察结果强烈表明，尽管在较低浓度下，帕博西尼仍可聚集到溶酶体中，但不能排除它在其他细胞位置的存在。
证明帕博西尼可以扩散溶酶体在洗出药物的细胞外介质，我们量化帕博西尼住衰老sk-梅尔-103细胞荧光(处理1μM帕博西尼7天)播种在流室幻灯片。提高检测、细胞暴露在一个额外的治疗4μM帕博西尼24h。然后，用无药培养基流式细胞，每10分钟拍摄一次共聚焦图像，并进行定量。本实验设置显示，帕博西尼衰老细胞在无药物介质中流动时荧光信号逐渐消失。约4.5h后，细胞内的帕博西尼荧光减少了~50%。
当每隔1小时拍摄图像时，观察到相同的动力学，这表明荧光信号的下降不是由于激光光漂白。骨肉瘤细胞Saos2港RB1基因的纯合缺失，因此耐帕博西尼在某种意义上，他们不接受细胞循环逮捕和衰老。有趣的是，Saos2细胞治疗帕博西尼也表现出相同的荧光信号模式作为溶酶体，尽管帕博西尼-fluorescence低的强度比衰老sk-梅尔-103细胞。与帕博西尼衰老SK-Mel-103细胞相比，Saos2细胞(~1小时内约50%)对帕博西尼细胞内荧光的冲刷速度更快。我们还跟踪了衰老SK-Mel-103细胞摄取帕博西尼的动力学。
为此，细胞衰老与1μM帕博西尼（哌柏西利）呈现了7天包含4μM帕博西尼与媒体流。荧光明显增加，约3h后达到平台期。综上所述，这些观察结果与帕博西尼进入溶酶体的可逆捕获相一致，这一过程被称为溶酶体捕获。这种现象在衰老细胞和非衰老细胞中都有发生，尽管衰老细胞中捕获的帕博西尼的数量高于非衰老细胞，可能是因为衰老细胞的溶酶体腔室较大的特点。详情请扫码咨询：
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