AKT信号的激活索拉非尼/索拉菲尼的治疗

　　为了更好地了解CD24是否对索拉非尼（索拉菲尼）耐药是必需的，我们在Huh7 / SR和Hep3B / SR细胞中用小的发夹RNA（shCD24）敲除了CD24。通过western印迹和qRT-PCR验证了击倒效率。我们调查了几种恶性肿瘤相关因素。首先，在不同浓度的索拉非尼处理后48h，通过CCK8分析检测细胞活力，我们发现CD24的下调可降低Huh7/SR和Hep3B / SR细胞的细胞活力，尤其是当索拉非尼处理超过1.5时μM。此外，Huh7 / SR和Hep3B / SR中CD24的敲低显着降低了其恶性行为，包括增殖和索拉非尼（1.5μM）治疗的抗凋亡能力。

　　因此，我们得出结论，CD24与索拉非尼耐药有关。然而，为了进一步了解CD24诱导的索拉非尼耐药机制，我们进行了全转录组shot弹枪测序（RNA-Seq），以确定Huh7 / SR和Huh7之间持续的细胞转录组变化。 SR shCD24（用1.5μM索拉非尼治疗）。在所有转录本的无监督聚类分析中，我们检测到两组样品的表达特征存在显着差异。

　　主成分分析（PCA）显示，当分析mRNA时，来自两组的样品显示出形成单独簇的趋势。使用差异表达的mRNA作为输入。我们发现了许多富集的途径，其中AKT/mTOR和自噬途径最为重要，但在其他地方进行了进一步研究。为证实RNA-Seq的预测，我们检测到AKT信号的激活索拉非尼的治疗。

　　我们发现，在Huh7 / SR细胞中，Thr308中的AKT（p-AKT）以及p-mTOR（Ser2448）的磷酸化显着降低，但在Huh7 / SR shCD24细胞中没有差异。在Hep3B / SR细胞中发现了相同的结果。这些结果可能表明CD24通过抑制AKT / mTOR信号转导来调节索拉非尼耐药性。我们还发现，通过RNA-seq数据，AKT的一种抑制剂PP2A显着增加，我们进一步证实了其转录和蛋白质表达。我们推测CD24通过PP2A诱导的AKT / mTOR抑制与索拉非尼耐药相关。我们研究了PP2A抑制剂冈田酸和AKT激动剂SC79处理后细胞活力的变化。在未使用索拉非尼处理的情况下，细胞活力没有显着变化，但是在Huh7 / SR和Hep3B / SR中，当抑制PP2A或增强AKT活性时，细胞活力均显着下降。我们用上述治疗方法进一步分析了AKT / mTOR的激活。我们发现降低的细胞生存力与索拉非尼的治疗与AKT / mTOR信号的激活有关。

　　由于RNA-Seq数据也表明自噬存在显着差异，并且自噬是AKT / mTOR信号传导的下游效应之一，因此我们继续探索自噬在CD24介导的索拉非尼耐药中的作用。基于此假设，我们通过使用IHC染色研究了人类临床样品中的此类信号传导，发现与索拉非尼敏感的组织相比，耐索拉非尼的HCC组织显示出AKT / mTOR的活化明显更低，但PP2A和LC3的表达增加-II。因此，我们着重研究CD24介导的自噬在索拉非尼耐药中的作用。我们首先检查了Huh7/SR细胞和Huh7 / SR CD24shRNA中自噬的水平。我们发现，用1.5μm索拉非尼（24 h）处理的Huh7 / SR CD24shRNA与Huh7 / SRCD24shRNA相比，LC3-II增加但p62减少。

　　透射电子显微镜显示，在Huh7 / SR细胞中存在大量的自噬小体形态特征的双膜液泡结构，但在Huh7 / SR CD24shRNA细胞中不存在。通过使用RFP-GFP标签的LC3，设计了一种荧光检测方法来监测自噬体。 GFP信号对酸性和/或蛋白水解条件敏感，而RFP更稳定。融合信号（黄色点）表示隔室尚未与溶酶体（如吞噬细胞或自噬体）融合。在此标准下，我们发现Huh7 / SR细胞与Huh7 / SR shCD24细胞相比具有更强的自噬能力。为研究自噬对于CD24诱导的索拉非尼耐药性进展是否必要，我们用1μnM处理了Huh7 / SR细胞。 其中。这么看来索拉非尼的效果针对与肝癌非常不错，更多详情可咨询下方微信。